Současné trendy v klinické Současné trendy v klinické imunologii a sérologiiimunologii a sérologii

JAN MARTINEK

OSNOVAOSNOVA

Základní principy metod v imunologii a sérologii

ImunoglobulinyProblematika infekční sérologie (vybrané

infekční agens)

Principy metod v imunologie a Principy metod v imunologie a sérologii - sérologii - DĚLENÍ METODDĚLENÍ METOD

HumorálníBuněčné

Metody nefelometrie a turbidimetrie

• Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG

• Princip: měření intenzity světla• precipitace v roztoku – přímé měření

množství precipitátu - zákal• kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)

TURBIDIMETRIE

NEFELOMETRIE

zdroj světla kyveta s precipitátem detektor

zdroj světla

detektor

kyveta s precipitátem

rozptyl světla

ElektroforézaElektroforéza

• Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především

• Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ).

• možnost denzitometrické kvantifikace

E L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z A

I I MM UU NN OO FF II XX AA CC EEI I MM UU NN OO FF II XX AA CC EE

Metody – EIAMetody – EIA

Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE …

Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením

Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA …

Metoda – ELISAMetoda – ELISA

Princip: komplex Ag - Ab detekován sekundární

protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza)

• komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab)

se odstraní promytím• vysoká citlivost (1ng/l)

ELISAELISA – průkazprůkaz antigenuantigenuELISAELISA – průkazprůkaz antigenuantigenu

TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ

SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

METODA CLIA – ADVIA CENTAURMETODA CLIA – ADVIA CENTAUR

Metoda – WB, ImunodotMetoda – WB, Imunodot

Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

Metoda – IFA Metoda – IFA

Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens

NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCENEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

Jaderné autoantigenypolynukleotidyhistonyribonukleoproteinyantigeny jadérekcentroméradalší antigeny

Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy

buněčné organelyantigeny cytoskeletudalší antigeny

Antigeny asociované s dělením buňky

centrioladělící vřeténkoseparační zóna buňky

Autoprotilátky na HEp-2 buňkách :

Komplement fixace a hemaglutinaceKomplement fixace a hemaglutinace komplement-fixační reakce je založena na vyvazování

komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM).

aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.

NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACENEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

Testy Buněčné imunityTesty Buněčné imunity

Funkční testy leukocytůStanovení počtu buněk

Funkční testyFunkční testy

Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem

Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)

Funkční testyFunkční testy

BasotestAktivita NK buněkBlastická transformace lymfocytů

Stanovení počtuStanovení počtu

Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií

• vrchol současných možností analýzy • buněčných suspenzí

• částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady

• cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem

PRŮTOKOVÁPRŮTOKOVÁ CYTOMETRIECYTOMETRIEPRŮTOKOVÁPRŮTOKOVÁ CYTOMETRIECYTOMETRIE

Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou

Vyjadřování výsledků - EIA Vyjadřování výsledků - EIA metodymetody

Index pozitivity – Cut off (referenční sérum)

0-0,9 – negativní

0,9-1,1 – hraniční

>1,1 - pozitivníKalibrační křivka – standardy

Vyjadřování výsledků - IFA Vyjadřování výsledků - IFA metodymetody

Subjektivní hodnocení, komentářHraničníSlabě pozitivníPozitivníSilně pozitivní

Vyjadřování výsledků – metody Vyjadřování výsledků – metody WB, ImunodotWB, Imunodot

Semikvantitativní hodnocení, komentářSubjektivní hodnocení v kombinaci se

software

Vyjadřování výsledků – Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrieprůtoková cytometrie

Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly)

U hematologických pacientů komentář

MULTIPLEXYMULTIPLEXY

V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“

Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu

„„Kuličkové“ Multiplexy Kuličkové“ Multiplexy

Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny

Detekce jakýchkoli protilátekNení zatím v rutinní praxi

IMUNOGLOBULINY A B-IMUNOGLOBULINY A B-LYMFOCYTYLYMFOCYTY

HemopoézaHemopoéza

BCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, Imunoglobuliny

GENETICKÁ ORGANIZACE IgHGENETICKÁ ORGANIZACE IgH

VH DH JH

S S S S S S S S S S

C C

C 3

C 1

C C

1

C 2

C 4

C C 2

Lokalizace genu v genomu:Lokalizace genu v genomu:

Těžký řetězec – 14 chromozom

Lehký řetězec – λ – 2 chromozom

k – 22 chromozom

Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)

Diferenciace B-lymfocytůDiferenciace B-lymfocytů

Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor

Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk

CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEKCHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK

DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDIONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU

kultivace

mikroskopie

PCR

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

INFEKČNÍCH NEMOCÍ:

NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ)

PRŮKAZ

Stanovení protilátek

• obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.)

• retrospektivní nález (epidemiologie)

Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

čas

IgG

IgA

IgM

Mn

ožst

ví p

roti

láte

k

DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDIDYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

EBVEBV

Souhrn - EBVSouhrn - EBV

Čeleď Herpesviridae, DNA virusKosmopolitněRozvojové země – v dětství, západní země – až

adolescenceCeloživotní nosičství (latentní infekce organismu)

- perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)

EBV - ProtilátkyEBV - Protilátky

Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test

Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA

Dynamika tvorby protilátekDynamika tvorby protilátek

Latentní fázeLatentní fáze

Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA

EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál

Lytická fázeLytická fáze

Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů

Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů

Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity

Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo

EBV - Nádory, genetikaEBV - Nádory, genetika

Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním

Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním

spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (X- vázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV)

Chlamydie - CharakteristikaChlamydie - Charakteristika

•„atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu •intracelulárnírůst •bez vlastního energetického metabolismu •=> nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových

kulturách •=> nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu

(beta-laktamováATB) •růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny

Chlamydie - DruhyChlamydie - Druhy

•Chlamydia pneumoniae–původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ???

•Chlamydia trachomatis•původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K)•lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3)•trachom (serotypyA, B, Ba, C)

•Chlamydia psittaci–původce „papouščínemoci“

•Chlamydia pecorum

Chlamydie - DiagnostikaChlamydie - Diagnostika

Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR

Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP

Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce

Hodnocení protilátek u Hodnocení protilátek u ChlamydiíChlamydií

IgM IgA IgG Hodnocení

- - - Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce)

+ - - Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní

+ +- +- Akutní infekce na počátku

+ + + Probíhající infekce

- - + Perzist.IgG po proběhlé infekci

- + +- Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky

BorrelieBorrelie

Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB

Nesrovnalosti mezi výrobci

Děkuji za pozornost