Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.

1. Reversibilní kovalentní modifikace. Katalytické vlastnosti řady enzymů se mění po kovalentní vazbě nějaké skupiny na jejich molekulu – nejčastěji fosforylace. Modifikující enzymy jsou proteinkinasy a proteinfosfatasy.

2. Allosterická kontrola. Allosterické proteiny obsahují regulační místa odlišná od substrátových. Allosterický z řečtiny „allos“ = další, „steros“ = uspořádání. Skládají se z podjednotek (protomerů). Mají schopnost kooperativity. Jako příklady enzym aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa) a neenzymový kyslíkový přenašeč hemoglobin.

3. Mnohočetné formy enzymů. Isozymy – jsou homologní enzymy katalyzující stejnou reakci, ale lišící se jemně ve struktuře a více v Km a Vlim a regulačních vlastnostech.

• 4. Proteolytická aktivace. Mnoho proteinů je syntetizováno v neaktivní formě. U enzymů jsou to zymogeny (proenzymy). Po odštěpení části řetězce přechází zymogen na aktivní enzym. Jako aktivující složky působí proteolytické enzymy jako chymotrypsin, pepsin a trypsin. Aktivace je ireversibilní. Kaspasy, proteolytické enzymy, účastnící se programové buněčné smrti, jsou aktivovány z formy prokaspas. Dalším příkladem je kaskáda enzymů při srážení krve.

5. Kontrola množstvím přítomného enzymu-kontrola na úrovni transkripce. Modul 11, ibiochemie.upol.cz; Regulace genové exprese. (P. Peč).

1. Regulace enzymové aktivity kovalentní modifikací.

• Nejčastější jsou fosforylace a defosforylace• Dalším způsobem modifikace je např.

acetylace. Acetylovány jsou histony (pomocné proteiny obalující DNA v chromosomech a při regulaci genů). Vysoce acetylované histony spojené s geny jsou aktivně přepisovány. Enzymy jsou acetyltransferasa a deacetylasa a jsou regulovány fosforylací.

• Modifikace není vždy reversibilní. Např. připojení ubiquitinu k proteinu.

Kovalentní modifikace proteinů – acetylace vedlejšího řetězce Lys

Sirtuiny: EC 3.5.1.98 histondeacetylasy nebo histonamidohydrolasy.

Protipólem jsou histonacetylasy EC 2.3.1.48

• Sirtuiny (silent information regulator, SIRT) jsou enzymy kódované skupinou vysoce konzervovaných genů přítomných v genomech organismů počínaje archebakteriemi až po eukaryota.

• Tyto enzymy patří do skupiny NAD+-dependentních deacetylas katalyzujících deacetylaci různých proteinů včetně histonů, p53, p300, acetyl-CoAsynthetasy a R-deacetylacitubulin.

• Schopnost deacetylace širokého spektra substrátů určuje klíčovou roli sirtuinů při různých biologických funkcích jako je např. oprava DNA, umlčení transkripce, stabilita genomu, apoptosa, signál insulinu a mobilizace tuků.

Sirtuiny• Sirtuiny – regulace umlčování genů. Sirtuiny vyžadují

pro deacetylaci např. histonů NAD+. Tato skupina enzymů slouží jako citlivý senzor energetického stavu buňky.

• Pokud je k dispozici dostatek živin a metabolismus pracuje na plné obrátky, vzniká velké množství NADH (inhibitor sirtuinů). Naopak, pokud nevzniká velké množství NADH nebo je veškerý NADH převeden na NAD+, díky zvýšené aktivitě dýchacího řetězce, sirtuiny nerušeně fungují.

• Co sirtuiny umějí ? • U kvasinek bylo zjištěno, že větší množství sirtuinů vede

k prodloužení života. Omezený přísun potravy (glukosy) vede k poklesu NADH, sirtuiny jsou aktivovány a deacetylují. Pustí se do histonů a dalších substrátů, které se podílejí na délce života.

Sirtuiny• U savců (u laboratorních myší) je nejdůležitějším

enzymem SIRT1. K jeho substrátům patří proteiny p53 nebo MyoD, které jsou zapojeny do programované buněčné smrti.

• Další cestou vlivu SIRT je tuková tkáň, kde interaguje s transkripčním faktorem PPAR gama a touto cestou brání tvorbě proteinů nutných k syntéze tuků. Tuky jsou místo uskladňování odbourávány.

• SIRT brzdí programovou buněčnou smrt i diferenciaci, mobilizuje zásoby tuků a. umožňuje jejich lepší spalování. Větší počet mitochondrií produkuje méně ROS.

• Účinnost SIRT lze zvýšit podáním resveratrolu, což je přírodní polyfenolická látka vyskytující se např. v hroznové slupce a jadérkách. Francouzský paradox !!

Resveratrol

Vysvětlivky k tabulce: Common covalent modification of protein activity

• Ras = onkogen – rat sarcoma viruses.

• Src = onkogen – Rous sarcoma viruses.

• Myristoyl-CoA = CH3 – (CH2)12 – CO-CoA

• Farnesylpyrofosfát (3 x prenyl, prenylace) –

CH3

CH3 CH3 CH3

O-P-O-P

Fosforylace je vysoce účinný způsob modifikace regulující aktivitu cílového proteinu.

Pyruvátdehydrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2

• PDK inaktivuje pyruvátdehydrogenasu fosforylací za účasti ATP.

• PDK se podílí na regulaci pyruvátdehdrogenasového komplexu jehož je PD prvním enzymem. PDK a pyruvátdehydrogenasový komplex jsou lokalizovány v matrix mitochondrií u eukaryot.

• Komplex převádí pyruvát, jako produkt glykolýzy vzniklý v cytoplasmě, na acetyl CoA., který je posléze oxidován v citrátovém cyklu za tvorby energie.

• PDK snižuje oxidaci pyruvátu v mitochondrii a zvyšuje převod pyruvátu na laktát v cytoplasmě.

• Opačné působení PDK- defosforylace – a aktivace pyruvátdehdrogenázového komplexu je katalyzováno fofoproteinfosfatasou nazývanou pyruvátdehydrogenasafosfatasa.

Regulace pyruvátdehydrogenasového komplexu

Pyruvátdehdrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2

• PDK je stimulována ATP, NADH a acetyl CoA.

• PDK je inhibována ADP, NAD+ CoA-SH a pyruvátem.

• • PDK je také inhibována farmakem

dichloroacetátem, který je sledován jako prostředek k léčení několika metabolických onemocnění – zvláště proti rakovině.

• PDK má čtyři isozymy – PDK1 až PDK4.

Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu:

• Pyruvátdehydrogenasa (E1)• Dihydrolipoyltransacetylasa (E2)• Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3)

• Např. komplex E. coli je 4 600 kD proteinový komplex. Mitochondriální komplex je 10 000 kD protein, obsahující 20 E2 trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3 dimerů.

• Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí, sumárně:

Pyruvát + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH

• Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát (TPP), koenzym A (CoA SH), NAD+, FAD a lipoamid.

17

Thiaminpyrofosfát – TPP, také thiamindifosfát TDP.

Váže se pevně, ale nekovalentně na pyruvátdekarboxylasu. Prekurzorem je

vitamin

B1 – thiamin.

Nekovalentní vazba TPP na

pyruvátdekarboxylasu.

Pyruvátdehydrogenasa (E1)Pyruvát dekarboxyluje za tvorby

hydroxyethyl-TPP meziproduktu.

N+

SCR1

CH3 R2

-

E1

TPP E1

+O C C CH3

O O

-

Pyruvát

H+

CO2

N+

SCR1

CH3 R2

H O C CH3-

E1

Hydroxyethyl- TPP E1

20

Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je vázána na E2 amidovou vazbou

přes -aminoskupinu Lys.

Lipoamid

CH

CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH

O NH

C

CH2S

SCH2

O

Lipoová kyselina Lysin

Dihydrolipoamid

CH

CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH

O NH

C

CH2

SH

CH2

O

SH

2H+ + 2e-

21

Hydroxyethylová skupina je přenesena

na dihydrolipoyltransacetylasu (E2). Hydroxyethylový karbanion je současně

oxidován na acetyl a lipoamid redukován na

disulfid. N

+S

CR1

CH3 R2

E1

TPP E1

+

Acetyl- dihydrolipoamid- E2

N+

SCR1

CH3 R2

H O C CH3-

E1

Lipoamid- E2

H+ N+

SCR1

CH3 R2

H O C CH3

S

E2

SH

-E1

E2

S

S

H+

OC

CH3

S

E2

SH

22

E2 (Dihydrolipoyltransacetylasa) poté katalyzuje transesterifikací, při které se

acetyl přenese na CoA za tvorby acetyl-CoA.

Acetyl- dihydrolipoamid- E2

OC

CH3

S

E2

SH

CoA SH

Dihydrolipoamid- E2

SH

E2

SH

+

O

S C CH3CoA

Acetyl- CoA

23

Regenerace lipoamidu na E2. Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný

FAD.

E3 (oxidovaná forma)

SH

E2

SH+S

FAD

S

E3 (redukovaná forma)

S

E2

S+SH

FAD

SH

24

Reoxidace redukovaného E3

(Dihydrolipoyldehydrogenasa ). Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby

NADH. FAD slouží spíše jako vodič elektronů !!!

E3 (oxidovaná forma)

S

FAD

S

S

FAD

S

H2

E3 (redukovaná forma)

SH

FAD

SH

NADH + H+NAD+

25

Aktivní místo

dihydrolipoamiddehydrogenasy.

Cys43

Cys48

FAD

NAD+

Tyr 181

Lipoyllysylové raménko E2 (2x)

• Raménko přenáší meziprodukty reakce mezi jednotlivými enzymy.

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

C

NH

O

CH2

SS

CH2

NH

CH

C

O

CH2

CH2

CH2

CH2

Lipoyllysylové raménko (plnì roztažené)

140 nm

27

Animace PD

• http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html

Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu.

Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu a tím i

respiraci.

Arsenitan

+

Dihydrolipoamid

+As

OH

OH

O

SH

R

SH

S

R

S

AsO 2 H2O

Organická slouèenina arsenu

+ +As OR1

SH

R

SH

S

R

S

AsR1 H2O

- -

29