Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Inovace studiamolekulární a buněčné biologie
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Genomika (KBB/GENOM)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Fyzické mapování
Fyzické kontigové mapy
Ing. Hana Šimková, CSc.
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Cíl přednášky
- seznámení s konstrukcí fyzických kontigových map a jejich ukotvováním
Klíčová slova
- fyzické mapování, fingerprinting, kontig, ukotvování fyzických map, integrace genetických a fyzických map
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
KONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAP
Kontig – řetězec po sobě jdoucích fragmentů DNA vytvářejících spojitou sekvenciKontigová fyzická mapa se skládá z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů
Konstrukce fyzické kontigové mapy:
sestavování kontigů
ověřování správnosti kontigů pomocí genetických a cytogenetických markerů
integrace genetických a fyzických map
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
1) Sestavování kontigů
- z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů.
Překryvy je možno zjišťovat na základě
- analýzy restrikčních spekter (fingerprintů)
- vyhledávání společně se vyskytujících markerů
(STS, genetické markery)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Uspořádání klonů na základě srovnání restrikčních spekter(fingerprinting)
Fingerprint = unikátní spektrum restrikčních fragmentů získaných na základě štěpení 1 nebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů. Klony odvozené z jednoho místa genomu sdílejí určitou část restrikčního spektra.
Různé varianty fingerprintingu:a) štěpení 1 restrikční endonukleázou (RE) s 6-bp
restrikčním místem (cca 20-45 proužků na klon)- elektroforéza na agaróze, barvení ethidium bromidem - vizualizace téměř všech fragmentů jednoznačnější stanovení přesahů –spolehlivější, je možné zjistit velikost BAC klonu, nejlevnější omezená automatizace, nižší informační hodnotaAlternativní způsob vytváření fingerprintů- optickým mapováním.
Gibson a Muse, 2004
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Kombinace 2 enzymů, radioaktivní značení
b) štěpení více RE + koncové značení- radioaktivně- fluorescenčně
Analýza na polyakrylamidovém gelu- vertikální elektroforéza- sekvenátor
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Automatizovaný postup fyzického mapování BAC klonů
- izolace DNA z BAC klonů- štěpení 1 až 4 vzácněji štěpícími RE (s 6-bp místem) zanechávajícími kohezní konce- štěpení 1 často štěpící RE (s 4-bp místem) zanechávající tupé konce
- koncové značení fluorescenčně značenými ddNTP (1 až 4 různé barvičky) – jen u kohezních konců
Fragmenty 35-600 bp – získáme celkově až stovky fragmentů, viditelných (tj. nesoucích fluorescenční barvičku aspoň na 1 konci) do 50 pro 1 enzym.Optimum – 50-250 proužků pro všechny enzymy dohromady.
- frakcionace – sekvenátor – použití vnitřního standardu v každé kapiláře- vyhodnocení – program FPC (FingerPrintedContigs)
- porovná fingerprinty- poskládá klony do kontigů- navrhne nejkratší cestu pro sekvenování (minimum tiling path - MTP)
5‘
3‘
3‘
5‘
TCAGATC
CTAGA
CT*
*
T C T A G A
A G A T C T5’ 3’3’ 5’
G G C C
G G C CC C G G
C C G G XbaI+HaeIII
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
(adapted from Luo et al., Genomics, 2003)
EcoRIBamHI EcoRI HaeIII HaeIII
Využití kitu SNaPshot pro barevné značení
Výstup ze sekvenátoru
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Čtyřbarevné značení – oddělení barev
BamHI
EcoRI
XbaI
XhoI
Velikostní standard (Liz)
Luo et al. 2003
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Izolace DNAz BAC klonů
Kapilární elektroforéza(ABI3730)
Sestavování kontigů (Genoprofiler, FPC)
HICF (high information content fingerprinting)fingerprinting s vysokým informačním obsahem
Štěpení 5 restrikčními endonukleázami
Fluorescenční značení(SNaPshot kit)
(Luo et al, 2003, Genomics)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Konstrukce fyzické mapy
Výběr metody pro daný genom tak, aby byl dosažen
a) optimální počet analyzovaných proužků- méně proužků – nižší informační hodnota, větší relativní chyba- příliš mnoho proužků – více falešně pozitivních překryvů
b) dostatečná vzdálenost mezi proužky
Sulston cutoff score (Sulstonova prahové hodnota) vyjadřuje pravděpodobnost, že proužky společné pro 2 fingerprintované klony jsou výsledkem náhody. Pokud je hodnota nižší než tento uživatelem nastavený práh, klony jsou prohlášeny za překrývající se. Udává se jako e-n.
Větší genomy vyžadují mnohem nižší hodnotu Sulstonova skóre (vyšší n).
Meyers et al. 2004
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Závislost mezi Sulston cutoff scorea rozsahem překryvu BAC klonů
1e-75
70-80%
% překryvu klonů
1e- 45
50- 60%
křivka pro BAC klon o velikosti cca 125 kb
Paux et al. 2008
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Manuálníupravování sestavy
(merging, splitting, killing…)
[e-45]
[e-65]
[e-60]
[e-55]
[e-50]
Počáteční sestavení (automaticky s vysokou
přísností)
Následné automatické sestavení s klesající
přísností(merging, DQing…)
[e-70]
[e-75]
Sestavení fyzické mapy chromozómu 3B pšenices použitím programu FPC
Poče
t kon
tigů
[e-25]
Paux et al. 2008
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Vyhledávání překryvů na základě společných markerů
Obvykle slouží k doplnění fingerprintingu, propojení dosud nespojených kontigů. Lze použít i samostatně, ale velmi pracné, vyžaduje vysokou hustotu markerů.
STS markery (sequence-tagged site – místo se sekvenční adresou) –krátká sekvence, kterou lze amplifikovat pomocí PCR a kterou lze lokalizovat na jediném místě v genomua) odvozeny z náhodných sekvencí (nemusí být polymorfní)b) odvozeny z genetických markerů (např. ISBP, mikrosatelitů, RFLP)c) odvozeny z ESTů (expressed sequence tag – místo s expresní adresou)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
2) Ověřování správnosti kontigů
- integrací genetických a fyzických map – markery ve vazbě by měly kolokalizovat na dlouhých kontizích
- sekvence z obou konců dlouhých kontigů použít k odvození genetických markerů – ty by měly kosegregovat
Tyto koncové sekvence (BAC end sequences = BES) také mohou posloužit ke spojení dvou kontigů:- odvození sondy z konce kontigu- skríning knihovny- vytipování BACu – získání jeho koncové sekvence – může být
na dalším kontigu
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
VIRTUÁLNÍ SPOJENÍ DVOU KONTIGŮ
Ukotvování kontigů pomocí FISH
- pro kontigy, které nelze ukotvit- pro kontrolu orientace kontigů- pro zjištění velikosti mezer mezi kontigy
172A10(5 kb)
140C18(8 kb)
173K08(3 kb)
FISH
Podle FISH jsou oba kontigy lokalizovány na distálním konci 3B
Dvoubarevná FISH
172A10 + 173K08 140C18 + 173K08
Na základě dvoubarevné FISH jsou oba kontigy v těsné blízkosti nebo se překrývají
PŘEKRYV ?
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Zjištění vzájemné pozice dvou BAC klonů pomocí FISH na natažených chromozómech
mitotickéchromozómy natažené chromozómy
mezera cca 30 kb
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Xbcd907
Xcdo460
Xtam61
Xabg471
Xbcd1418
Xfbb378
Xbcd131
Xfba360
Xbg131
Xtam63
Xmwg11
Xcfa2191Xcfa2226 Xcfd143 Xgwm493 Xbarc147 Xbarc133 Xbarc75 Xbarc102 Xgwm389 Xgwm533-1
Xcfa2170
Xgwm566Xgwm72 Xcfd4 Xgwm285 Xgwm77 Xgpw1146 Xgwm376 Xgwm284
Xgwm533-2 Xwmc43 Xgwm264
Xcnl3 Xgwm131 Xgwm108 Xgwm112 Xbarc164
Xgwm114 Xpsp2151 Xgwm547
Xgwm299 Xbarc77 Xbarc84
Xgwm247Xgwm181 Xgwm340
XksuH7Xpsr689
Genetická mapa
Xgwm389 Xgwm533 Xbarc68 Xbarc156
Xgwm493 Xbarc87 Xbarc147 Xbarc102 Xbarc75
Xgpw1146 Xgwm376 Xgwm131 Xgwm108 Xbarc77 Xbarc1077 Xgwm112 Xgwm114
Xcfa2170 Xgwm547 Xgwm181 Xbarc84
Xcfa2191 Xcfa2226 Xcfd143 Xbarc133
Xcfd79 Xgwm566 Xgwm72 Xgwm285 Xgwm77 Xbarc139
Xwmc43
Xcfd4
Xgwm284 Xbarc164 Xcnl3
Xpsp3081
Xgwm299 Xpsp2151 Xgwm247 Xgwm340 Xfwm4
Deleční mapa
XksuH7 Xpsr689
Xpsr170 XksuG62
3BS-1
3BS-8
C
3BS-9
3BL-7
3BL-2
3BL-10
Xbarc73 Xgwm264 Xgwm144
Xbarc203 Xbarc1044
Xbarc164
?
Fyzická mapa
3) Integrace genetických a fyzických map
Paux et al. 2008
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Přímé ukotvování:- z genetických map do kontigů pomocí geneticky
zamapovaných markerů(SSR, EST, RFLP, DArT, SNP…)
A) Přímé ukotvování (forward contig anchoring)
Provádí se skríning knihovny genetickými markery - je možné i s větším počtem sond –poolovací strategie (strategie směsných vzorků):
a) PCR skríning – pooly z knihovny – miskové+řádkové+sloupcové (=3D), ale i 5D, 6D pooly.
b) skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě
Paux et al., Science, 2008)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
a) Vytváření třídimenzionálních směsných vzorků (poolů)
48 PCR reakcí umožní proskrínovat 8 misek po 384 jamkách, tedy najít 1 pozitivní klon mezi 3072.
CNRGV Toulouse
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
b) Hybridizace na membránách o vysoké hustotě
Po hybridizaci s radioaktivně značnou sondou
Nanášecí schéma 5x5,každý klon 2x
Detail
Nylonová membránas nanesenými klony
CNRGV Toulouse
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
Skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě- sonda z 1 markeru (např. EST)- směsné sondy z několika typů markerů - sondy z překrývajících se oligonukleotidů (overgos)
odvozeny z kusu známé unikátní sekvence – 2 částečně se překrývající oligonukleotidy
8 bp22-24 bp
22-24 bp konce doplněny radioaktivně značenými oligonukleotidy
vysoká specificita hybridizace (odvozeno z jednokopiových sekvencí), silné signály, lze snadno odmýt – hybridizační membránu je možno použít víckrát poměrně vysoké náklady na syntézu overgos
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.I n v
e s
t i c
e d
o r
o z
v o
j e
v z
d ě
l á
v á
n í
B) Reverzní ukotvování (reverse contig anchoring)Reverzní ukotvování (chromosome landing):
- ukotvování kontigů BAC klonů na genetickou mapu (přes genetický marker obsažený v kontigu) – využívá markerů odvozených ze sekvencí BAC klonů nebo konců BAC klonů (BES) – SSR, ISBP, SNP, …, které se geneticky zamapují za použití mapovací populace
Paux et al., Science, 2008)
