Post on 16-Nov-2020
transcript
Zvyšovaacuteniacute konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelstviacute biologie CZ1072200150316
Materiaacutely k přednaacuteškaacutem z předmětu Mikrobiologie a virologie ndash čaacutest mikrobiologie
BOTMVP a BOTMVPX
Katedra botaniky PřF UP v Olomouci
RNDr Barbora Mieslerovaacute PhD Doc RNDr Michaela Sedlaacuteřovaacute PhD
VERZE LS 20102011
Byly inovovaacuteny v raacutemci projektu
Zvyšovaacuteniacute konkurenceschopnosti studentů oboru
botanika a učitelstviacute biologie CZ1072200150316
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ 1 Mikroskopickeacute vyšetřeniacute morfologickyacutech vlastnostiacute
tvar velikost a seskupeniacute buněk pohyblivost a umiacutestěniacute bičiacuteků barveniacute dle Grama barveniacute spor barveniacute na acidorezistenci důkaz pouzder a inkluziacute 2 Kultivačniacute vlastnosti tvar a pigmentace koloniiacute na pevneacutem meacutediu růst v tekuteacutem meacutediu (např v bujoacutenu)
Postupy vedouciacute k určeniacute mikroorganismu jsou často značně složiteacute a nezřiacutedka i zdlouhaveacute Spočiacutevajiacute ve vyhodnocovaacuteniacute mikroskopickyacutech kultivačniacutech a biochemickyacutech znaků a vlastnostiacute mikrobů ktereacute porovnaacutevaacuteme s popisy znaacutemyacutech rodů a druhů uvedenyacutech v literatuře bdquoBergeyacutes Manual of determinative Bacteriologyldquo
3 Fyziologickeacute vlastnosti vztah ke kysliacuteku teplotniacute rozmeziacute pro růst rezistence k teplotě tolerance k NaCl citlivost ke žlučovyacutem soliacutem na antibiotika
4 Biochemickeacute testy využiacutevaacuteniacute zdrojů uhliacuteku (např glukoacutezy laktozy aj) důkaz redukce dusičnanů hydrolyacutezy škrobu želatiny a eskulinu důkaz tvorby indolu sirovodiacuteku acetoinu a dekarboxylaacutez lyzinu nebo
ornitinu důkaz produkce některyacutech enzymů jako např katalaacutezy oxidaacutezy fosfataacutezy
ureaacutezy koagulaacutezy szlig-galaktozidaacutezy aj
5 Molekulaacuterně biologickeacute metody (analyacuteza DNA ndash štěpeniacute hybridizace radioaktivniacute proacuteby PCR)
6 Doplňujiacuteciacute testy
zjištěniacute seacuterologickyacutech vlastnostiacute citlivosti k bakteriofaacutegům El mikroskopie ultratenkyacutech řezů buněk chemickaacute analyacuteza buněčneacute stěny (přiacutetomnost peptidoglykanů teikoovyacutech kyselin) stanoveniacute obsahu G + C v DNA a dalšiacute
1 MIKROSKOPICKEacute HODNOCENIacute MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů jejich morfologii vnějšiacute vzhled velikost a zaacutekladniacute cytologickeacute uspořaacutedaacuteniacute buněčneacute
U bakteriiacute je přiacutemeacute mikroskopickeacute určeniacute až do druhů prakticky nemožneacute Některeacute mikromycety určit můžeme
MIKROSKOPIE VE SVĚTELNEacuteM POLI ndash v přiacutemeacutem působeniacute světelnyacutech paprsků osvětleniacute vestavěno v noze stativu Imerzniacute objektivy ndash použiacutevaacuteme k prohliacuteženiacute bakteriiacute a jemnyacutech struktur kde potřebujeme dosaacutehnout zvětšeniacute kolem 1000x Označeniacute 2 čarami Mezi preparaacutet a čelniacute čočku imerzniacuteho objektivu se umiacutestiacute kapka imerzniacuteho oleje (tj cedrovyacute olej s indexem lomu 1515 při teplotě 18degC)
MIKROSKOPIE V TEMNEacuteM POLI ndash při osvětlovaacuteniacute šikmyacutemi paprsky předměty daacutevajiacute kontrastniacute obraz předmět zaacuteřiacute v zorneacutem poli FAacuteZOVYacute KONTRAST ndash Použitiacute na preparaacutety způsobujiacuteciacute faacutezovou modulaci světla (vliv indexu lomu) Při stejneacute amplitudě světelneacute vlny změna jejiacute faacuteze Zařiacutezeniacute faacutezoveacuteho kontrastu sloužiacute obecně k tomu že přeměňuje faacutezoveacute změny vlněniacute vznikleacute po průchodu faacutezovyacutem objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vklaacutedaacute faacutezovaacute destička V ohniskoveacute rovině kondenzoru je prstencovaacute faacutezovaacute clonka Zřetelnějšiacute rozlišeniacute čaacutestic nezbarveneacuteho preparaacutetu tak že jsou struktury jasnějšiacute nebo tmavšiacute než pozadiacute
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Materiaacutely k přednaacuteškaacutem z předmětu Mikrobiologie a virologie ndash čaacutest mikrobiologie
BOTMVP a BOTMVPX
Katedra botaniky PřF UP v Olomouci
RNDr Barbora Mieslerovaacute PhD Doc RNDr Michaela Sedlaacuteřovaacute PhD
VERZE LS 20102011
Byly inovovaacuteny v raacutemci projektu
Zvyšovaacuteniacute konkurenceschopnosti studentů oboru
botanika a učitelstviacute biologie CZ1072200150316
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ 1 Mikroskopickeacute vyšetřeniacute morfologickyacutech vlastnostiacute
tvar velikost a seskupeniacute buněk pohyblivost a umiacutestěniacute bičiacuteků barveniacute dle Grama barveniacute spor barveniacute na acidorezistenci důkaz pouzder a inkluziacute 2 Kultivačniacute vlastnosti tvar a pigmentace koloniiacute na pevneacutem meacutediu růst v tekuteacutem meacutediu (např v bujoacutenu)
Postupy vedouciacute k určeniacute mikroorganismu jsou často značně složiteacute a nezřiacutedka i zdlouhaveacute Spočiacutevajiacute ve vyhodnocovaacuteniacute mikroskopickyacutech kultivačniacutech a biochemickyacutech znaků a vlastnostiacute mikrobů ktereacute porovnaacutevaacuteme s popisy znaacutemyacutech rodů a druhů uvedenyacutech v literatuře bdquoBergeyacutes Manual of determinative Bacteriologyldquo
3 Fyziologickeacute vlastnosti vztah ke kysliacuteku teplotniacute rozmeziacute pro růst rezistence k teplotě tolerance k NaCl citlivost ke žlučovyacutem soliacutem na antibiotika
4 Biochemickeacute testy využiacutevaacuteniacute zdrojů uhliacuteku (např glukoacutezy laktozy aj) důkaz redukce dusičnanů hydrolyacutezy škrobu želatiny a eskulinu důkaz tvorby indolu sirovodiacuteku acetoinu a dekarboxylaacutez lyzinu nebo
ornitinu důkaz produkce některyacutech enzymů jako např katalaacutezy oxidaacutezy fosfataacutezy
ureaacutezy koagulaacutezy szlig-galaktozidaacutezy aj
5 Molekulaacuterně biologickeacute metody (analyacuteza DNA ndash štěpeniacute hybridizace radioaktivniacute proacuteby PCR)
6 Doplňujiacuteciacute testy
zjištěniacute seacuterologickyacutech vlastnostiacute citlivosti k bakteriofaacutegům El mikroskopie ultratenkyacutech řezů buněk chemickaacute analyacuteza buněčneacute stěny (přiacutetomnost peptidoglykanů teikoovyacutech kyselin) stanoveniacute obsahu G + C v DNA a dalšiacute
1 MIKROSKOPICKEacute HODNOCENIacute MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů jejich morfologii vnějšiacute vzhled velikost a zaacutekladniacute cytologickeacute uspořaacutedaacuteniacute buněčneacute
U bakteriiacute je přiacutemeacute mikroskopickeacute určeniacute až do druhů prakticky nemožneacute Některeacute mikromycety určit můžeme
MIKROSKOPIE VE SVĚTELNEacuteM POLI ndash v přiacutemeacutem působeniacute světelnyacutech paprsků osvětleniacute vestavěno v noze stativu Imerzniacute objektivy ndash použiacutevaacuteme k prohliacuteženiacute bakteriiacute a jemnyacutech struktur kde potřebujeme dosaacutehnout zvětšeniacute kolem 1000x Označeniacute 2 čarami Mezi preparaacutet a čelniacute čočku imerzniacuteho objektivu se umiacutestiacute kapka imerzniacuteho oleje (tj cedrovyacute olej s indexem lomu 1515 při teplotě 18degC)
MIKROSKOPIE V TEMNEacuteM POLI ndash při osvětlovaacuteniacute šikmyacutemi paprsky předměty daacutevajiacute kontrastniacute obraz předmět zaacuteřiacute v zorneacutem poli FAacuteZOVYacute KONTRAST ndash Použitiacute na preparaacutety způsobujiacuteciacute faacutezovou modulaci světla (vliv indexu lomu) Při stejneacute amplitudě světelneacute vlny změna jejiacute faacuteze Zařiacutezeniacute faacutezoveacuteho kontrastu sloužiacute obecně k tomu že přeměňuje faacutezoveacute změny vlněniacute vznikleacute po průchodu faacutezovyacutem objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vklaacutedaacute faacutezovaacute destička V ohniskoveacute rovině kondenzoru je prstencovaacute faacutezovaacute clonka Zřetelnějšiacute rozlišeniacute čaacutestic nezbarveneacuteho preparaacutetu tak že jsou struktury jasnějšiacute nebo tmavšiacute než pozadiacute
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ 1 Mikroskopickeacute vyšetřeniacute morfologickyacutech vlastnostiacute
tvar velikost a seskupeniacute buněk pohyblivost a umiacutestěniacute bičiacuteků barveniacute dle Grama barveniacute spor barveniacute na acidorezistenci důkaz pouzder a inkluziacute 2 Kultivačniacute vlastnosti tvar a pigmentace koloniiacute na pevneacutem meacutediu růst v tekuteacutem meacutediu (např v bujoacutenu)
Postupy vedouciacute k určeniacute mikroorganismu jsou často značně složiteacute a nezřiacutedka i zdlouhaveacute Spočiacutevajiacute ve vyhodnocovaacuteniacute mikroskopickyacutech kultivačniacutech a biochemickyacutech znaků a vlastnostiacute mikrobů ktereacute porovnaacutevaacuteme s popisy znaacutemyacutech rodů a druhů uvedenyacutech v literatuře bdquoBergeyacutes Manual of determinative Bacteriologyldquo
3 Fyziologickeacute vlastnosti vztah ke kysliacuteku teplotniacute rozmeziacute pro růst rezistence k teplotě tolerance k NaCl citlivost ke žlučovyacutem soliacutem na antibiotika
4 Biochemickeacute testy využiacutevaacuteniacute zdrojů uhliacuteku (např glukoacutezy laktozy aj) důkaz redukce dusičnanů hydrolyacutezy škrobu želatiny a eskulinu důkaz tvorby indolu sirovodiacuteku acetoinu a dekarboxylaacutez lyzinu nebo
ornitinu důkaz produkce některyacutech enzymů jako např katalaacutezy oxidaacutezy fosfataacutezy
ureaacutezy koagulaacutezy szlig-galaktozidaacutezy aj
5 Molekulaacuterně biologickeacute metody (analyacuteza DNA ndash štěpeniacute hybridizace radioaktivniacute proacuteby PCR)
6 Doplňujiacuteciacute testy
zjištěniacute seacuterologickyacutech vlastnostiacute citlivosti k bakteriofaacutegům El mikroskopie ultratenkyacutech řezů buněk chemickaacute analyacuteza buněčneacute stěny (přiacutetomnost peptidoglykanů teikoovyacutech kyselin) stanoveniacute obsahu G + C v DNA a dalšiacute
1 MIKROSKOPICKEacute HODNOCENIacute MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů jejich morfologii vnějšiacute vzhled velikost a zaacutekladniacute cytologickeacute uspořaacutedaacuteniacute buněčneacute
U bakteriiacute je přiacutemeacute mikroskopickeacute určeniacute až do druhů prakticky nemožneacute Některeacute mikromycety určit můžeme
MIKROSKOPIE VE SVĚTELNEacuteM POLI ndash v přiacutemeacutem působeniacute světelnyacutech paprsků osvětleniacute vestavěno v noze stativu Imerzniacute objektivy ndash použiacutevaacuteme k prohliacuteženiacute bakteriiacute a jemnyacutech struktur kde potřebujeme dosaacutehnout zvětšeniacute kolem 1000x Označeniacute 2 čarami Mezi preparaacutet a čelniacute čočku imerzniacuteho objektivu se umiacutestiacute kapka imerzniacuteho oleje (tj cedrovyacute olej s indexem lomu 1515 při teplotě 18degC)
MIKROSKOPIE V TEMNEacuteM POLI ndash při osvětlovaacuteniacute šikmyacutemi paprsky předměty daacutevajiacute kontrastniacute obraz předmět zaacuteřiacute v zorneacutem poli FAacuteZOVYacute KONTRAST ndash Použitiacute na preparaacutety způsobujiacuteciacute faacutezovou modulaci světla (vliv indexu lomu) Při stejneacute amplitudě světelneacute vlny změna jejiacute faacuteze Zařiacutezeniacute faacutezoveacuteho kontrastu sloužiacute obecně k tomu že přeměňuje faacutezoveacute změny vlněniacute vznikleacute po průchodu faacutezovyacutem objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vklaacutedaacute faacutezovaacute destička V ohniskoveacute rovině kondenzoru je prstencovaacute faacutezovaacute clonka Zřetelnějšiacute rozlišeniacute čaacutestic nezbarveneacuteho preparaacutetu tak že jsou struktury jasnějšiacute nebo tmavšiacute než pozadiacute
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
3 Fyziologickeacute vlastnosti vztah ke kysliacuteku teplotniacute rozmeziacute pro růst rezistence k teplotě tolerance k NaCl citlivost ke žlučovyacutem soliacutem na antibiotika
4 Biochemickeacute testy využiacutevaacuteniacute zdrojů uhliacuteku (např glukoacutezy laktozy aj) důkaz redukce dusičnanů hydrolyacutezy škrobu želatiny a eskulinu důkaz tvorby indolu sirovodiacuteku acetoinu a dekarboxylaacutez lyzinu nebo
ornitinu důkaz produkce některyacutech enzymů jako např katalaacutezy oxidaacutezy fosfataacutezy
ureaacutezy koagulaacutezy szlig-galaktozidaacutezy aj
5 Molekulaacuterně biologickeacute metody (analyacuteza DNA ndash štěpeniacute hybridizace radioaktivniacute proacuteby PCR)
6 Doplňujiacuteciacute testy
zjištěniacute seacuterologickyacutech vlastnostiacute citlivosti k bakteriofaacutegům El mikroskopie ultratenkyacutech řezů buněk chemickaacute analyacuteza buněčneacute stěny (přiacutetomnost peptidoglykanů teikoovyacutech kyselin) stanoveniacute obsahu G + C v DNA a dalšiacute
1 MIKROSKOPICKEacute HODNOCENIacute MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů jejich morfologii vnějšiacute vzhled velikost a zaacutekladniacute cytologickeacute uspořaacutedaacuteniacute buněčneacute
U bakteriiacute je přiacutemeacute mikroskopickeacute určeniacute až do druhů prakticky nemožneacute Některeacute mikromycety určit můžeme
MIKROSKOPIE VE SVĚTELNEacuteM POLI ndash v přiacutemeacutem působeniacute světelnyacutech paprsků osvětleniacute vestavěno v noze stativu Imerzniacute objektivy ndash použiacutevaacuteme k prohliacuteženiacute bakteriiacute a jemnyacutech struktur kde potřebujeme dosaacutehnout zvětšeniacute kolem 1000x Označeniacute 2 čarami Mezi preparaacutet a čelniacute čočku imerzniacuteho objektivu se umiacutestiacute kapka imerzniacuteho oleje (tj cedrovyacute olej s indexem lomu 1515 při teplotě 18degC)
MIKROSKOPIE V TEMNEacuteM POLI ndash při osvětlovaacuteniacute šikmyacutemi paprsky předměty daacutevajiacute kontrastniacute obraz předmět zaacuteřiacute v zorneacutem poli FAacuteZOVYacute KONTRAST ndash Použitiacute na preparaacutety způsobujiacuteciacute faacutezovou modulaci světla (vliv indexu lomu) Při stejneacute amplitudě světelneacute vlny změna jejiacute faacuteze Zařiacutezeniacute faacutezoveacuteho kontrastu sloužiacute obecně k tomu že přeměňuje faacutezoveacute změny vlněniacute vznikleacute po průchodu faacutezovyacutem objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vklaacutedaacute faacutezovaacute destička V ohniskoveacute rovině kondenzoru je prstencovaacute faacutezovaacute clonka Zřetelnějšiacute rozlišeniacute čaacutestic nezbarveneacuteho preparaacutetu tak že jsou struktury jasnějšiacute nebo tmavšiacute než pozadiacute
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
1 MIKROSKOPICKEacute HODNOCENIacute MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů jejich morfologii vnějšiacute vzhled velikost a zaacutekladniacute cytologickeacute uspořaacutedaacuteniacute buněčneacute
U bakteriiacute je přiacutemeacute mikroskopickeacute určeniacute až do druhů prakticky nemožneacute Některeacute mikromycety určit můžeme
MIKROSKOPIE VE SVĚTELNEacuteM POLI ndash v přiacutemeacutem působeniacute světelnyacutech paprsků osvětleniacute vestavěno v noze stativu Imerzniacute objektivy ndash použiacutevaacuteme k prohliacuteženiacute bakteriiacute a jemnyacutech struktur kde potřebujeme dosaacutehnout zvětšeniacute kolem 1000x Označeniacute 2 čarami Mezi preparaacutet a čelniacute čočku imerzniacuteho objektivu se umiacutestiacute kapka imerzniacuteho oleje (tj cedrovyacute olej s indexem lomu 1515 při teplotě 18degC)
MIKROSKOPIE V TEMNEacuteM POLI ndash při osvětlovaacuteniacute šikmyacutemi paprsky předměty daacutevajiacute kontrastniacute obraz předmět zaacuteřiacute v zorneacutem poli FAacuteZOVYacute KONTRAST ndash Použitiacute na preparaacutety způsobujiacuteciacute faacutezovou modulaci světla (vliv indexu lomu) Při stejneacute amplitudě světelneacute vlny změna jejiacute faacuteze Zařiacutezeniacute faacutezoveacuteho kontrastu sloužiacute obecně k tomu že přeměňuje faacutezoveacute změny vlněniacute vznikleacute po průchodu faacutezovyacutem objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vklaacutedaacute faacutezovaacute destička V ohniskoveacute rovině kondenzoru je prstencovaacute faacutezovaacute clonka Zřetelnějšiacute rozlišeniacute čaacutestic nezbarveneacuteho preparaacutetu tak že jsou struktury jasnějšiacute nebo tmavšiacute než pozadiacute
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Obraz objektu v obrazoveacutem ohnisku objektivu vznikaacute interferenciacute vlněniacute přiacutemeacuteho ktereacute jakoby prochaacutezelo preparaacutetem beze změny a vlněniacute difrakčniacuteho posunuteacuteho na faacutezoveacutem objektu Vzniklyacute obraz je nepozorovatelnyacute protože rozdiacutely v indexu lomu předmětu a okoliacute jsou velmi maleacute Vlněniacute přiacutemeacute a difrakčniacute lze oddělit což je velmi vyacuteznamneacute protože to umožňuje modulovat amplitudu a faacutezi světla přiacutemeacuteho bez ovlivněniacute světla difrakčniacuteho a naopak Provaacutediacute se to tak že se do obrazoveacuteho ohniska objektivu umisťuje tzv faacutezovaacute deska (ve tvaru prstence) kteraacute posunuje faacutezi přiacutemeacuteho světla a vyacutesledkem interference obou druhů vlněniacute pak vznikaacute kontrastniacute obraz faacutezoveacuteho objektu
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Normaacutelniacute obraz
Faacutezovyacute kontrast
Zaacutestin (temneacute pole)
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Mycelium Morchella esculenta Barveniacute DAPI
Buňka kvasinky
FLUORESCENČNIacute MIKROSKOPIE ndash schopnost některyacutech sloučenin fluoreskovat při ozaacuteřeniacute UV světlem Jsou-li zmiacuteněneacute laacutetky přiacutetomny v buňce (např riboflavin chlorofyl) mluviacuteme o primaacuterniacute fluorescenci (přirozeneacute) Sekundaacuterniacute fluorescence je vyvolaacutena zabarveniacutem sledovanyacutech čaacutestiacute fluoreskujiacuteciacutemi barvivy tzv fluorochromy Sekundaacuterniacute fluorescenci lze využiacutet pro detekci mikroorganismů v diagnostice mykobakteriiacute při studiu povrchovyacutech struktur hub
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
ELEKTRONOVYacute MIKROSKOP Je obdobou optickeacuteho mikroskopu kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optickeacute čočky elektromagnetickyacutemi čočkami což je vlastně vhodně tvarovaneacute magnetickeacute pole Využiacutevaacute se toho že vlnoveacute deacutelky urychlenyacutech elektronů jsou o mnoho řaacutedů menšiacute než fotonů viditelneacuteho světla Proto maacute elektronovyacute mikroskop mnohem vyššiacute rozlišovaciacute schopnost a může tak dosaacutehnout mnohem vyššiacuteho zvětšeniacute (až 1000000times) Rozdiacutel od světelneacuteho mikroskopu je 4 až 5 řaacutedů Transmisniacute (TEM) x rastrovaciacute (= skenovaciacute ndash SEM)
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Escherichia coli Listerie monocytogenes
SEM Fotografie
Golovinomyces cichoracearum (padliacute)
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Mikroskopovaacuteniacute živyacutech mikroorganismů ndash NATIVNIacute PREPARAacuteT Nejčastěji použiacutevaacuteme v diagnostice parazitologickeacute mykologickeacute a bakteriologickeacute (při sledovaacuteniacute pohyblivosti a děleniacute bakteriiacute)
Podložniacute kryciacute skla vhodnyacute roztok (destilovanaacute voda fyziologickyacute roztok)
Chceme-li pozorovat mikroba delšiacute dobu abychom sledovali růst staacutele stejnyacutech buněk
Kochova komůrka ndash pozorujeme mikroby ve visuteacute kapce
Agarovaacute komůrka ndash pozorovaacuteniacute suspenziacute mikrobů nebo spor ve vytemperovaneacutem agaru okraje se zalepiacute sterilniacutem parafinem či vazeliacutenou
Kochova komůrka
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
MIKROSKOPICKYacute PREPARAacuteT BAKTERIIacute A HUB
Kokaacutelniacute tvar bakteriiacute Tyčinkovityacute tvar bakteriiacute
Konidie a konidiofory r Penicillium
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
VITAacuteLNIacute BARVENIacute Vitaacutelniacute barveniacute metyleacutenovou modřiacute (001) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Vitaacutelniacute barveniacute kongo červeniacute (001-005) (živeacute buňky nezbarveneacute)
Barveniacute cotton modřiacute (1) ndash živaacute vlaacutekna mikromycet se intenzivně barviacute mrtvaacute jsou bezbarvaacute
Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici ndash cotton
blue
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
MIKROSKOPIE FIXOVANYacuteCH ORGANISMŮ Na čisteacute odmaštěneacute podložniacute sklo naneseme kapku mikrobiaacutelniacute suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agaroveacute plotně
Preparaacutety na podložniacutem skle nejčastěji fixujeme protaženiacutem plamenem kahanu
Fixovaacuteniacute chemickyacutemi činidly ndash methylalkoholem ethanolem acetonem
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
DIAGNOSTICKEacute BARVENIacute MIKROORGANISMŮ
Je barviacuteciacute postup předepsanyacute typem barviv jehož positivniacute či negativniacute vyacutesledek je určovaciacutem znakem při rozlišovaacuteniacute mikrobů
Nejvyacuteznamnějšiacute ndash Gramovo barveniacute bakteriiacute
JEDNODUCHEacute BARVENIacute - sloužiacute k rozlišeniacute tvarů buněk
Barveniacute karbolfuschsinem
Negativniacute barveniacute tušiacute
Barveniacute spor - použiacutevaacute se na diferenciaci spor bacilů a klostridiiacute
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis
BARVENIacute KARBOLFUCHSINEM
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Bacillus atrophaeus
NEGATIVNIacute BARVENIacute
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
BARVENIacute SPOR
Spory jsou rezistentniacute těliacuteska vytvaacuteřenaacute uvnitř buněk některyacutech mikroorganismů Velmi těžko se barviacute i po fixaci neboť majiacute silnyacute špatně prostupnyacute obal
Chceme-li spory obarvit musiacuteme použiacutet koncentrovanaacute barviva za tepla nebo různaacute mořidla Tiacutem se uvolniacute stěna spory a stane se pro barvivo prostupnějšiacute Takto obarveneacute spory se těžko odbarvujiacute kyselinami a jinyacutemi sloučeninami (např alkoholem) čehož se využiacutevaacute k diferenciaci spor Barveniacute podle Wirtze a Conklina naacutetěr na podložniacutem skle fixujeme teplem Převrstviacuteme 5 vodnyacutem roztokem malachitoveacute zeleně nechaacuteme působit bez zahřiacutevaacuteniacute 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do vyacutestupu par Barvivo nesmiacute vařit ani se odpařit Po slitiacute barviva barvivo znovu doplniacuteme a postup ještě 2x zopakujeme Oplaacutechneme vodou a dobarviacuteme karbolfuchsinem 1-2 minuty
Bacillus subtilis
Těla bakteacuteriiacute se při tomto postupu obarviacute růžově spory jsou zeleneacute
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Ziehl-Neelsenovo barveniacute Zeihl-Neelsenovo barveniacute je metoda jež se použiacutevaacute k průkazu tzv
acidorezistentniacutech bakteriiacute konkreacutetně mykobakteriiacute a nokardiiacute a některyacutech aktinomycet Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen Jednaacute se o jednu z nejpoužiacutevanějšiacutech metod diagnostiky tuberkuloacutezy
Princip barveniacute Metoda je založena na principu že acidorezistetniacute bakterie majiacute schopnost
přijiacutemat zahřaacutetaacute barviva (karbolfuchsin) kteraacute se udržiacute ve stěně i po naacutesledneacutem odbarveniacute kyselyacutem alkoholem
Postup Preparaacutet fixovanyacute nad plamenem se přelije koncentrovanyacutem karbolfuchsinem Oplaacutechne se vodou Preparaacutet se odbarviacute kyselyacutem alkoholem (1 HCl v 70 etanolu) dokud
neodteacutekaacute z preparaacutetu čiryacute alkohol Oplaacutechne se vodou a dobarviacute se buď metylenovou modřiacute nebo malachitovou
zeleniacute Acidorezistentniacute bakterie se jeviacute po vyacutesledneacutem barveniacute červeně (až růžově) na
modreacutem (v přiacutepadě metylenoveacute modři) nebo zeleneacutem pozadiacute (v přiacutepadě malachitoveacute zeleně) (viz obraacutezek)
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Mycobacterium tuberculosis
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
DIFERENCIAacuteLNIacute GRAMOVO BARVENIacute
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
SCHEacuteMA STAVBY G+ A G- BAKTERIAacuteLNIacute STĚNY
Peptidoglykan (mukopeptid murein)
+ teichoovaacute kyselina lipoteichoovaacute kys polysacharidy
+ lipopolysacharidy lipoproteiny
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Escherichia coli Micrococcus luteus
Daacutele Pseudomonas Salmonella Daacutele Staphylococcus aureus Streptococcus Bacillus subtilis
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
MĚŘENIacute MIKROORGANISMŮ
Stanoveniacute jejich velikosti
Okulaacuteroveacute měřiacutetko ndash diacutelky stupnice
Skutečnaacute deacutelka diacutelků zaacutevisiacute na deacutelce tubusu a použiteacutem objektivu
Objektivovyacute mikrometr ndashstanoveniacute velkosti 1 diacutelku
Př 12 diacutelků okulaacuteroveacute stupnice odpoviacutedaacute 7 diacutelků objektivoveacute stupnice (tj 70 um) 1 diacutelek pak měřiacute 7012 = 58 um
V současneacute době měřiacutetka jsou přiacutemo vložena do sniacutemaciacuteho zařiacutezeniacute ndash počiacutetač naacutem na obraacutezku ukaacuteže měřiacutetko pokud zadaacuteme spraacutevnou velikost použiteacuteho objektivu
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
2 KULTIVAČNIacute URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ Při teacuteto metodě nepozorujeme vlastniacute mikroorganismus co do jeho morfologie ale sledujeme jeho životniacute projevy v tekutyacutech i pevnyacutech meacutediiacutech
Volba meacutedia je daacutena předevšiacutem druhem mikroorganismu (jinaacute meacutedia voliacuteme pro bakterie heterotrofniacute či autotrofniacute jinaacute pro mikromycety)
Kultivačniacute živneacute půdy musiacute vyhovovat všem naacuterokům na živiny a současně musiacute mikroorganismům poskytovat podobneacute prostřediacute jakeacute majiacute v přirozenyacutech substraacutetech v nichž se v přiacuterodě vyskytujiacute a rostou Kromě optimaacutelniacuteho zastoupeniacute živin musiacute živnaacute meacutedia splňovat tyto podmiacutenky
10486331048633 vhodnaacute vlhkost 10486331048633 optimaacutelniacute pH 10486331048633 vhodnyacute osmotickyacute tlak 10486331048633 optimaacutelniacute redoxpotenciaacutel (vhodneacute aerobniacute a anaerobniacute podmiacutenky) 10486331048633 přiacutetomnost růstovyacutech faktorů Neexistuje jedineacute univerzaacutelniacute kultivačniacute meacutedium ktereacute by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
KULTIVAČNIacute MEacuteDIA Neexistuje univerzaacutelniacute meacutedium na ktereacutem by rostly všechny bakterie Podle konzistence TUHEacute - agary - izolačniacute TEKUTEacute - bujoacuten ndash pomnožovaciacute POLOTEKUTEacute ndash majiacute kreacutemovitou konzistenci (obsahujiacute niacutezkou koncentraci ztužujiacuteciacute komponenty ndash 05 agaru nebo želatiny) sloužiacute např ke stanoveniacute pohyblivosti bakteriiacute pro kultivaci anaerobů či k jinyacutem speciaacutelniacutem uacutečelům Podle použitiacute ZAacuteKLADNIacute - MPA krevniacute agar bujoacutenhellip SELEKTIVNIacute - Slanetz-Bartley agarhellip DIAGNOSTICKEacute - Endo-agar Tergitol 7hellip Podle přiacutepravy PŘIROZENAacute - z mleacuteka masoveacuteho vyacuteluhu ryacuteže mrkve bramboru půdniacuteho extraktuhellip SYNTETICKAacute - voda min laacutetky zdroj uhliacuteku dusiacuteku stopoveacute prvky růstoveacute faktory vitamiacuteny aminokyselinyhellip POLOSYNTETICKAacute - syntetickeacute + pepton kasein sladinahellip
Masopeptonovyacute agar (MPA) masovyacute extrakt 25 g pepton 100 g chlorid sodnyacute 50 g glukoacuteza 50 g agar 150 g destilvoda 10000 ml
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
UNIVERZAacuteLNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash roste na nich velkyacute počet fyziologicky různorodyacutech mikroorganismů (např masopeptonovyacute agar) Vzhledem k metabolickeacute různorodosti mikroorganismů zejmeacutena bakteriiacute však nelze předpoklaacutedat že by na nějakeacute živneacute půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsaženeacute ve vzorku Takovaacute živnaacute půda neexistuje
SELEKTIVNIacute ŽIVNEacute PŮDY ndash tyto půdy podporujiacute svyacutem složeniacutem růst pouze určiteacute skupiny mikroorganismů a ostatniacute potlačujiacute Selektivity se dosahuje přidaacutevaacuteniacutem některyacutech chemikaacuteliiacute barviv antibiotik nebo i uacutepravou pH
DIAGNOSTICKEacute ŽIVNEacute PŮDY - obsahujiacute určityacute substraacutet kteryacute je schopna využiacutevat pouze určitaacute skupina mikroorganismů a indikaacutetor signalizujiacuteciacute využiacutevaacuteniacute tohoto substraacutetu Mikroorganismy na těchto půdaacutech rostou v charakteristickyacutech koloniiacutech Přiacutekladem je Endův agar kteryacute je určen pro zjišťovaacuteniacute schopnosti gram negativcniacutech bakteriiacute využiacutevat laktoacutezu jako zdroj uhliacuteku Indikaacutetorem je siřičitanem odbarvenyacute fuchsin Bakterie využiacutevajiacuteciacute laktoacutezu rostou na teacuteto půdě v podobě červeně zbarvenyacutech koloniiacute ostatniacute jsou růžoveacute nebo bezbarveacute
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Kultivačniacute půdy - přiacuteprava složeniacute
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
OČKOVAacuteNIacute ŽIVNYacuteCH PŮD
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
ROZDĚLENIacute MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLIacuteKU
OBLIGAacuteTNĚ AEROBNIacute ndash jsou aktivniacute pouze v prostřediacute s dostatečnou koncentraciacute kysliacuteku (např rody Pseudomonas Mycobacterium Vibrio pliacutesně a kvasinky)
FAKULTATIVNĚ ANAEROBNIacute ndash v přiacutetomnosti kysliacuteku rostou obvykle leacutepe mohou však růst i za jeho nepřiacutetomnosti (např rody Escherichia Staphylococcus)
MIKROAEROFILNIacute ndash rostou v přiacutetomnosti kysliacuteku ale za nižšiacute koncentrace než je ta atmosfeacuterickaacute (asi 20) a mikroaerofiloveacute vyžadujiacute koncentraci kolem 2 (např rody Campylobacter Lactobacillus)
OBLIGAacuteTNĚ ANAEROBNIacute ndash rostou pouze v nepřiacutetomnosti kysliacuteku kteryacute je pro toxickyacute (např Většina druhů rodu Clostridium)
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
CHARAKTER RŮSTU PODEacuteL VPICHU DO AGAROVEacute PŮDY (POUZE U BAKTERIIacute)
Vpichem se očkuje 24 h staraacute bujoacutenovaacute kultura a kultivace při 30-37degC
a) Aerobniacute (v horniacute čaacutesti vpichu) b)mikroaerofilniacute c) fakultativně anaerobniacute (rostou po celeacute deacutelce vpichu) d)anaerobniacute mikroorganismy (rostou na spodniacute čaacutesti vpichu)
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
AEROBNIacute KULTIVACE
Aerobniacute mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskaacutech šikmyacutech agarech nebo v niacutezkyacutech vrstvaacutech kapalin
Pro rychleacute pomnoženiacute aerobniacutech mikroorganismů ndash syceniacute kysliacutekem - třepaacuteniacutem na třepačkaacutech aeraciacute
ANAEROBNIacute KULTIVACE
Fakultativně anaerobniacute a mikroaerofilniacute mikroorganismy rostou v prostřediacute se sniacuteženyacutem obsahem kysliacuteku a zvyacutešenyacutem tlakem CO2 Očkujeme vpichem rozmiacutechaacuteniacutem do svislyacutech agarů do vysokyacutech vrstev kapaliny o maleacutem povrchu redukujiacuteciacute laacutetky
Obligaacutetně anaerobniacute mikroorganismy rostou jen v prostřediacute bez kysliacuteku a kysliacutek je pro ně jedem Z jejich kultivačniacuteho prostřediacute musiacuteme odstranit kysliacutek
-Přidaacuteniacutem redukujiacuteciacutech sloučenin (siřičitan sodnyacute redukovaneacute železo)
-Povařeniacutem tekuteacute půdy (zbaveniacute kysliacuteku)
-Kultivace v anaerostatech (vyčerpaacuteniacute kysliacuteku nahrazeniacute dusiacutekem CO2)
-Soužitiacute anaerobniacutech organismů s aerobniacutemi (ktereacute spotřebovaacutevajiacute kysliacutek)
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Anaerobniacute kultivačniacute hrnec
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
HODNOCENIacute NAROSTLYacuteCH KOLONIIacute ndash RŮST NA PEVNYacuteCH PŮDAacuteCH Rozlišeniacute na
BAKTERIAacuteLNIacute KOLONIE HOUBOVEacute KOLONIE
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
U BAKTERIIacute A KVASINEK ZJIŠŤUJEME Tvar koloniiacute
Povrch koloniiacute
Okraj
Relieacutef
Konzistenci kolonie kašovitaacute hlenovitaacute
Transparenci kolonie
Barva kolonie
Změnu půdy v okoliacute kolonie
Vrůstaacuteniacute koloniiacute do půdy
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
TYPY BAKTERIAacuteLNIacuteCH KOLONIIacute
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
MORFOLOGIE KOLONIIacute BAKTERIIacute
Okrouhlyacute tvar koloniiacute
Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Zvlněnyacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Laločnatyacute tvar koloniiacute
Mycobacterium smegmatis
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Sektorovityacute tvar koloniiacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Pseudomonas aeruginosa
Profil zvyacutešenyacute
TYPY PROFILU KOLONIIacute
Streptomyces albus
Profil vypouklyacute
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Streptococcus salivarius
Tvar vypouklyacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Tvar knofliacutekovityacute
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Bacillus licheniformis
Tvar bradavčityacute
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
TYPY OKRAJŮ KOLONIIacute
Okraje hladkeacute
Serratia marcescens
Okraje vroubkovaneacute
Bacillus anthracis
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Nocardia asteroides Okraje vlaacutekniteacute
Thiomonas sp
Okraje prstoviteacute (caput medusae)
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
S koncentrickou stavbou
Escherichia coli
Okraje svraštěleacute
Neznaacutemyacute izolaacutet
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Paenibacillus dendritiformis ve stresovyacutech podmiacutenkaacutech
Rhizoidniacute okraje
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Hladkeacute (smooth) x drsneacute (rough) kolonie bakteriiacute
Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
3 FYZIOLOGICKEacute VLASTNOSTI Vyšetřeniacute na pohyblivost Lze k tomu použiacutet nativniacute preparaacutet připravenyacute z vyšetřovaneacute kultury kteryacute po
překrytiacute kryciacutem skliacutečkem mikroskopujeme v zaacutestinu nebo na temneacutem poli Nezaměnit s Brownovyacutem pohybem
Kultivačniacutem vyšetřeniacutem kultura se očkuje do polotuheacute agaroveacute půdy s 01-
05 agaru a maacute různeacute způsoby provedeniacute Do polotuheacuteho meacutedia ve zkumavce očkujeme bakteriaacutelniacute kulturu vpichem do
hloubky 4-5 cm po inkubaci (1-3 dny) pohybliveacute kultury prorůstajiacute z vpichu celyacutem meacutediem a vytvaacuteřejiacute zaacutekal Nepohybliveacute kultury rostou jen ve vpichu Důležityacutem diagnostickyacutem znakem může byacutet zjištěniacute zaacutevislosti pohyblivosti na inkubačniacute teplotě (např Yersinia enterocolitica je pohyblivaacute při 22deg C a nepohyblivaacute při 37deg C)
Odlišeniacute bliacutezkyacutech rodů z č Enterobactericeae (laktoacutezapozitivniacutech) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
4 URČOVAacuteNIacute MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKEacute ČINNOSTI
Mikroorganismy se vyznačujiacute velmi bohatou biochemickou činnostiacute
Rozmanitost teacuteto činnosti ndash využitiacute ndash vyacuteroba antibiotik různyacutech organickyacutech kyselin vitamiacutenů kvasneacute procesy
Některeacute druhy biochemickyacutech reakciacute jsou u jednotlivyacutech mikroorganismů staacuteleacute jsou pro ně typickeacute a často jsou specifickeacute pro jednotliveacute druhy uvnitř rodu
10486331048633 schopnost fermentace různyacutech sacharidů 10486331048633 schopnost utilizace různyacutech substraacutetů jakožto zdroje uhliacuteku 10486331048633 hydrolyacuteza určityacutech substraacutetů 10486331048633 aktivita přiacuteslušnyacutech enzymů 10486331048633 produkce specifickyacutech metabolitů 10486331048633 schopnost hemolyacutezy 10486331048633 různeacute dalšiacute testy
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
A SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNYacuteCH SACHARIDŮ HYDROLYacuteZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS)
Škrob je polysacharid kteryacute se působeniacutem enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzovaacuten přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušujiacute glykosidickeacute vazby) Škrob se barviacute jodovyacutem roztokem modře zatiacutemco jeho rozkladneacute produkty barevnou reakci nedaacutevajiacute Zkoumanou kulturu bakteriiacute naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovyacutem agarem Stejně tak zaočkujeme kontrolniacute mikroorganismus (na dalšiacute misku) a inkubujeme obě misky při 37degC 48 hodin Po inkubaci polijeme povrch živneacute půdy Lugolovyacutem roztokem a pozorujeme zda došlo k hydrolyacuteze škrobu Pokud ano kolem naacutetěru vzniknou nezbarveneacute zoacuteny Pokud k hydrolyacuteze nedošlo půda s nerozloženyacutem škrobem se zbarviacute intenzivně modře Vyacutesledky je nutno odečiacutetat hned modreacute zbarveniacute po kraacutetkeacute době miziacute Pokud vznikne červeneacute až hnědeacute zbarveniacute znamenaacute to že škrob byl rozložen čaacutestečně (na dextriny)
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Průkaz zkvašovaacuteniacute cukrů - do zkumavek ktereacute obsahujiacute peptonovou vodu s 1cukru glukoacutezu sacharoacutezu laktoacutezu manitol xyloacutezu a bromthymolovou modř jako indikaacutetor inokulujeme kolonii V reakci se využiacutevaacute změny pH při zkvašovaacuteniacute cukrů V pozitivniacutem přiacutepadě dochaacuteziacute k okyseleniacute bujoacutenu a tiacutem k zežloutnutiacute
PRŮKAZ ZKVAŠOVAacuteNIacute CUKRŮ
Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testovaacuteniacutem zkvašovaacuteniacute cukrů Použiacutevaacuteme tzv plynovku (malaacute zkumavka umiacutestěnaacute dnem vzhůru do zkumavky testujiacuteciacute zkvašovaacuteniacute glukoacutezy) Pokud danyacute kmen produkuje plyn hromadiacute se v plynovce jako bublinka
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
B TESTY ZALOŽENEacute NA PŘEMĚNAacuteCH DUSIacuteKATYacuteCH LAacuteTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLYacuteZA MOČOVINY)
Test je založen na principu toho že močovina (urea) je některyacutemi mikroby využiacutevaacutena jako substraacutet enzymem ureasou kteryacute tyto mikroby produkujiacute Urea je hydrolyzovaacutena na amoniak a oxid uhličityacute Rozkladem močoviny se zvyacutešiacute pH živneacuteho meacutedia což se projeviacute změnou barvy přidaneacuteho acidobazickeacuteho indikaacutetoru (nejčastěji fenoloveacute červeně) Test se použiacutevaacute např pro rozlišeniacute rodu Proteus od některyacutech jinyacutech G- tyčinek
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENIacute AKTIVITY DEKARBOXYLAS)
Při dekarboxylaci aminokyselin působeniacutem enzymů některyacutech bakteriiacute dochaacuteziacute ke vzniku CO2 a přiacuteslušneacuteho aminu čiacutemž se zvyacutešiacute pH půdy Enzym je specifickyacute pro danou aminokyselinu a působiacute za anaerobniacutech podmiacutenek Zvyacutešeniacute pH se zjistiacute přiacutedavkem vhodneacuteho indikaacutetoru např bromkresolpurpuru Na stanoveniacute dekarboxylas aminokyselin byla vypracovaacutena řada metod V současneacute době se nejčastěji použiacutevaacute metoda dle Moumlllera kteraacute je univerzaacutelniacute metodou na stanovovaacuteniacute dekarboxylas pro viacutece aminokyselin (lysin ornithin arginin kys glutamovaacute) K zaacutekladniacutemu meacutediu stačiacute pouze přidat přiacuteslušnou aminokyselinu Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využiacutevaacute k biochemickeacute diagnostice zejmeacutena čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella Enterobacter Citrobacter)
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY)
Některeacute mikroorganismy rozklaacutedajiacute aminokyselinu tryptofan působeniacutem enzymu tryptophanasy za vzniku indolu Vedlejšiacutemi produkty jsou kyselina pyrohroznovaacute a amoniak
Důkaz tvorby indolu Kovaczovyacutem činidlem (potvrzeniacute Escherichia coli)
Důkaz tvorby indolu se provaacutediacute v živneacutem meacutediu se zvyacutešenyacutem obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačniacutem meacutediu) a za nepřiacutetomnosti glukosy neboť glukosa produkci indolu inhibuje Indol se prokaacuteže specifickou chemickou reakciacute s některyacutem z uvedenyacutech činidel
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
C PROTEAacuteZY A PEPTIDAacuteZY Z těchto enzymů majiacute vyacuteznam pro diagnostiku ty ktereacute jsou vylučovaacuteny do prostřediacute Na proteolytickeacute vlastnosti izolovaneacute bakteriaacutelniacute kultury usuzujeme na zaacutekladě degradace biacutelkovin (nejčastěji kaseinu želatiny elastinu) v diagnostickeacute půdě
Plotnovaacute metoda - podle FRAZIERa meacutediem je masopeptonovyacute agar s přiacutedavkem 04 želatiny Vyšetřovaneacute kmeny očkujeme izolačniacutem způsobem a inkubujeme 3 dny při 37deg C Po inkubaci kulturu převrstviacuteme 5 - 10 ml 12 roztoku HgCl2 a sledujeme jejiacute okraje Želatinolyacuteza se projeviacute projasněniacutem meacutedia v okoliacute kultivačniacute čaacutery
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Test s karbogel-disky vyšetřovanyacute kmen očkujeme do MPB do ktereacuteho přidaacuteme několik karbogelovyacutech disků (želatinou spojenyacute praacuteškovyacute uhliacutek) Želatinolyacuteza se projeviacute uvolňovaacuteniacutem uhliacuteku z disků do meacutedia Tato modifikace je využiacutevaacutena i v komerčniacutech testech např API
Schopnost hydrolyzovat želatinu může byacutet využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae Pseudomonaceae
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
KOAGULAacuteZOVYacute TEST Suspektniacute kolonie se přeočkujiacute do zkumavky s tekutyacutem meacutediem kteryacutem je kraacuteličiacute plazma Inkubace probiacutehaacute ve vodniacute laacutezni 4 až 6 hod při teplotě 37 degC test je pozitivniacute v přiacutepadě kdy se vytvořiacute velkeacute geloveacute sraženiny
Pozitivniacute koagulaacutezovyacute test
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
D OSTATNIacute BIOCHEMICKEacute TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODIacuteKU)
Stanoveniacute produkce H2S z aminokyselin v tekuteacute půdě Některeacute bakterie uvolňujiacute z aminokyselin obsahujiacuteciacutech siacuteru (methionin cystein) sirovodiacutek Důkaz vznikleacuteho H2S lze proveacutest reakciacute se solemi těžkyacutech kovů (Fe Pb Bi) kdy vznikajiacute tmaveacute sulfidy Tvorba sirovodiacuteku je charakteristickaacute pro hnilobneacute bakterie ndash jsou nežaacutedouciacute kontaminaciacute zejmeacutena v potravinaacuteřskeacutem průmyslu
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
TEST NA TVORBU KATALASY
Některeacute bakterie tvořiacute enzym katalasu kteryacute rozklaacutedaacute peroxid vodiacuteku na vodu a molekulaacuterniacute kysliacutek Katalasu tvořiacute předevšiacutem aerobniacute bakterie (anaerobniacutem bakteriiacutem chybiacute) Na sterilniacute podložniacute skliacutečko naneseme kapku 3 roztoku peroxidu vodiacuteku do ktereacute asepticky přeneseme očkovaciacute kličkou testovanou kulturu bakteriiacute Toteacutež provedeme s kontrolniacutem mikroorganismem Přiacutetomnost katalasy se projeviacute unikaacuteniacutem plynu (bublinky kysliacuteku)
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKAacute ČINNOST BAKTERIIacute)
Stanoveniacute některyacutech fyziologickyacutech vlastnostiacute (tvorba extracelulaacuterniacutech enzymů a hemolysinů) se uacutezce proliacutenaacute s kultivačniacutemi metodami Ke zjištěniacute hemolytickeacute aktivity se použiacutevaacute krevniacuteho agaru V okoliacute kolonie může dojiacutet buď k uacuteplneacute nebo neuacuteplneacute hemolyacuteze Při neuacuteplneacute hemolyacuteze neboli viridaci dochaacuteziacute k čaacutestečneacutemu rozrušeniacute hemoglobinu na zelenohnědyacute pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovaacuteny Při uacuteplneacute hemolyacuteze dojde k uacuteplneacutemu rozloženiacute hemoglobinu i lyacutezi erytrocytů takže kolem kolonie dojde k vytvořeniacute průhledneacuteho dvorce Tvorba hemolysinů je typickaacute pro řadu patogenniacutech bakteriiacute ale i některyacutech nepatogenniacutech (některeacute streptokoky Staphylococcus aureus hemolytickeacute Escherichia coli Pseudomonas některeacute bacily apod) Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využiacutet i při různyacutech CAMP testech
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Krevniacute agar = zaacuteklad většiny půd v klinickeacute bakteriologii 5-10 defibrinovaneacute ovčiacutekoňskeacute krve k ochlazeneacutemu agaru Identifikace bakteriiacute podle hemolytickeacute aktivity (rozkladu erytrocytů pod koloniiacute) bull αndashhemolyacuteza (čaacutestečnaacute) ndash vznikaacute zelenyacute verdoglobin (Streptococcus viridans) bull β-hemolyacuteza ndash kompletniacute rozklad červenyacutech krvinek v okoliacute kolonie (např Streptococcus haemolyticus S pyogenes Staphylococcus aureus) bull γ-hemolyacuteza ndash žaacutednaacute hemolytickaacute aktivita
httpfvlvfuczsekce_ustavymikrobiologie
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
IDENTIFIKACE BAKTERIIacute STANDARDIZOVANYacuteMI TESTOVACIacuteMI SYSTEacuteMY
Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech reakciacute uspořaacutedanyacute do minimalizovanyacutech kultivačniacutech objemů dovolujiacuteciacute i za těchto podmiacutenek co nejdokonalejšiacute určeniacute mikroba
K identifikaci bakteriiacute do rodů je třeba miacutet k dispozici minimaacutelně desiacutetku biochemickyacutech reakciacute zahrnujiacuteciacute jak reakce buněčnyacutech složek tak vyacutesledky biochemickeacute činnosti bakteriaacutelniacute populace
Pro zařazeniacute do druhů se počet potřebnyacutech znaků mnohonaacutesobně zvyšuje
Ziacuteskaneacute uacutedaje jsou ponejviacutece porovnaacutevaacuteny s kompendiem bdquoBergeyacutes Manual of Determinated Bacteriologyldquo V teacuteto praacuteci je v podstatě zařazen každyacute dokonale popsanyacute bakteriaacutelniacute druh se všemi znaky ktereacute bylo do současneacute doby možno ziacuteskat Neustaacuteleacute doplňovaacuteniacute a zpřesňovaacuteniacute
Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovyacutem druhem uloženyacutem v přiacuteslušneacute sbiacuterce mikroorganismů
K serioacutezniacutemu určeniacute bakteriaacutelniacuteho kmene je nutno testovat a vyhodnocovat vyacutehradně čistou kulturu
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCIacute DIAGNOSTICKYacuteCH TESTŮ ndash MIKROTESTŮ Tyto diagnostickeacute soupravy vyraacuteběneacute centraacutelně jsou na rozdiacutel od klasickyacutech biochemickyacutech metod rychlejšiacute a standardnějšiacute Obvykle se jednaacute o reprezentativniacute soubor biochemickyacutech testů uspořaacutedanyacutech na plastovyacutech mikrodestičkaacutech V jamkaacutech těchto destiček jsou dehydratovanaacute diagnostickaacute meacutedia s přiacuteslušnyacutemi substraacutety Očkuje se suspenziacute z čistyacutech kultur o předem daneacute hustotě Po 18 ndash 24 hodinoveacute inkubaci kdy dochaacuteziacute ke změnaacutem ve zbarveniacute meacutediiacute se vyacutesledky odečiacutetajiacute a vyhodnocujiacute se buď převedeniacutem na přiacuteslušnyacute koacuted podle něhož se pak provede identifikace v identifikačniacutem registru nebo se vyacutesledky vyhodnotiacute pomociacute počiacutetačovyacutech programů Každaacute souprava obsahuje naacutevod na použitiacute tabulky pro zapisovaacuteniacute vyacutesledků pomocnaacute činidla (parafinovyacute olej a reagencie) Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakteriiacute izolovanyacutech z klinickeacuteho materiaacutelu potravin pitneacute i povrchoveacute vody půdy apod V současneacute době se vyraacutebějiacute desiacutetky diagnostickyacutech systeacutemů a distribuuje je řada firem Tyto systeacutemy se neustaacutele inovujiacute a doplňujiacute
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Miniaturizovaneacute a standardizovaneacute klasickeacute testy (ukaacutezka API testu k identifikaci přiacuteslušniacuteků č Enterobacteriaceae)
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
5 MOLEKULAacuteRNĚ BIOLOGICKEacute METODY Rychlaacute a spolehlivaacute identifikace mikroorganismů
Velmi perspektivniacute poskytujiacute spolehliveacute informace vhodneacute pro zpracovaacuteniacute velkeacuteho množstviacute vzorků Jsou nezaacutevisleacute na kultivaci mikroorganismů
Metody se uplatňujiacute v situaciacutech kdy infekčniacute agens roste pomalu kultivuje se obtiacutežně přiacutepadně se zatiacutem pěstovat nedaacute - Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Legionella Mycoplasma pneumoniae
Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastějšiacute) potom takeacute specifickyacutech proteinů
1 EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (přiacutemaacute lyze buněk) 2 PURIFIKACE NUKLEOVYacuteCH KYSELIN (Odstraněniacute buněčnyacutech struktur
včetně cukernyacutech složek a proteinů)
3 ŠTIacutePAacuteNIacute DNA
Zkraacuteceniacute na menšiacute fragmenty ndash restrikce (použitiacute restrikčniacutech endonukleaacutez)
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
4 PCR- POLYMERAacuteZOVAacute ŘETĚZOVAacute REAKCE Jednoduchaacute metoda zmnoženiacute (amplifikace) DNA in vitro pomociacute DNA-
polymeraacutezy Využiacutevaacute opakovanyacutech cyklů synteacutezy kousku DNA vymezeneacuteho dvěma primery
Velice citlivaacute na detekci mikroorganismu Průběh 1 Počaacutetečniacute denaturace ndash několik minut při teplotě 95degC 30 cyklu 2 Denaturace 94degC 30 sek 3 Nasednutiacute primeru ndash annealing 50degC 1 min 4 Synteacuteza DNA ndash extenze primeru 72degC 1 min 5 Konečnaacute extenze ndash dokončeniacute synteacutezy čaacutestečnyacutech produktů ndash 72degC 10
minut Prakticky se PCR provaacutediacute v termocykleru PRIMERY - kraacutetkeacute uacuteseky jednořetězcoveacute DNA 18 ndash 25 baacuteziacute - unikaacutetniacute sekvence = vaacutežou se na oblast na začaacutetku uacuteseku DNA kteryacute se maacute namnožit (komplementaacuterniacute) - mezi primery sekvence dlouhaacute 100 - 600 baacuteziacute použitiacute 2 primerů nasedajiacute v
protisměrneacute orientaci
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Taq polymeraacuteza ndash DNA polymeraacuteza ndash katalyzuje synteacutezu DNA z volnyacutech nukleotidů Termostabilniacute polymeraacuteza izolovanaacute z Thermus aquaticus bakterie žijiacuteciacute v horkyacutech pramenech ndash přežije podmiacutenky PCR
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
Potřeba na rozlišeniacute jednotlivyacutech fragmentů
Třiacuteděniacute je založeno na odlišnosti v jejich deacutelce
Gel ndash molekulaacuterniacute prostorovaacute siacuteť ndash agaroacutezovyacute polyakrylamidovyacute gel
Elektroforeacuteza ndash pohyb v elektrickeacutem poli od zaacuteporneacute ke kladneacute elektrodě
Obarveniacute gelu fluorescenčniacutem barvivem ndash ethidium bromidem
Pod UV transluminaacutetorem ndash molekuly DNA začnou v gelu zaacuteřit
Přidaacuteniacute markerů molekuloveacute hmotnosti ndash znaacutemyacutech molekul nukleovyacutech kyselin
TŘIacuteDĚNIacute MOLEKUL NUKLEOVYacuteCH KYSELIN GELOVAacute ELEKTROFOREacuteZA
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
6 IMUNOLOGICKEacute METODY
K identifikaci bakteriiacute je možno teacutež použiacutet imunologickyacutech metod pokud vyrobiacuteme specifickeacute protilaacutetky pro skupiny druhy či serotypy mikrobů
Imunologickaacute reakce se zviditelňuje sraacuteženiacutemale nejleacutepe odštěpeniacutem nebo naopak navaacutezaacuteniacutem fluorochromu což je možno detekovat fluorescenčniacutem mikroskopem
I kmeny teacutehož druhu mohou miacutet většiacute množstviacute serotypů ndash je možno použiacutet na detekci druhů tzv polyklonaacutelniacute protilaacutetky ktereacute uacutečinkujiacute na viacutece kmenů a typů
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
POTVRZENIacute LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Potvrzujiacute se seacuterologicky tzv Legionella Latex testem ndash
Seacuterotyp 1 seacuterotyp 2-15
Kaacutepne se do připraveneacuteho miacutesta kapka roztoku s protilaacutetkou a přenese se tam kolonie Legionella sp
Když dojde ke vzniku sraženiny ndash Legionella pneumophila daneacuteho seacuterotypu se potvrdila
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul
ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytickaacute metoda využiacutevanaacute ke stanoveniacute různyacutech antigenů Metoda je založena na vysoce specifickeacute interakci antigenu a protilaacutetky přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navaacutezaacuten enzym (nejčastěji peroxidaacuteza nebo alkalickaacute fosfataacuteza) Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substraacutetu kteryacute je přidaacuten do reakčniacute směsi na produkt kteryacute je barevnyacute (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskujiacuteciacute (fluorimetrickeacute stanoveniacute)
Koncentrace produktu je uacuteměrnaacute koncentraci antigenu nebo protilaacutetky ve vzorku Dalšiacutem společnyacutem znakem metod ELISA je zakotveniacute (adsorpce nebo kovalentniacute navaacutezaacuteniacute) antigenu nebo protilaacutetky na nerozpustnyacute nosič (často povrch reakčniacute naacutedobky nebo mikrotitračniacute destičky) což usnadňuje separaci imunochemicky navaacutezanyacutech molekul