Národní fytosanitární workshop“ Současné fytosanitární úkoly a směrování výzkumu v ČR z pohledu výzkumných i ostatních institucí v kontextu s rozvojem spolupráce v EU“
dne 3. 3. 2009
Současný výzkum virů a viroidů bramboru
Ing. Petr Dědič,CSc.Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.
Výzkumné projekty NAZV "Bezvirové brambory – eradikace viru S ve šlechtění a množení" (1997 - 2000)
"Bezvirové šlechtění bramboru" (2001 - 2004)
se zabývaly především problematikou udržovacího šlechtění a programy aktivního ozdravování.
Výsledky byly podkladem pro zařazení PVS do oficiálních kritérií kontroly zdravotního stavu základních stupňů sadby v posklizňových zkouškách u nás.
Významný vliv na stupeň reinfekcí PVS měly především přítomnost infikovaných rostlin v i mimo sledovaný porost, stupeň rezistence odrůd a počet roků expozice materiálu v polních podmínkách.
Explantátové kultury a zkrácený cyklus udržovacího šlechtění a množení přineslo výrazné pozitivní výsledky. Výhody těchto postupů nebyly plně využity na úseku šlechtění nových odrůd kde do registračních zkoušek byli přihlašováni kříženci se 100% infekce PVS a vlastní ozdravovací proces byl zahajován většinou až po, nebo těsně před povolením odrůdy.
Navazující projekt 1B53036 Novošlechtění bramboru na bezvirovém základěDoba řešení: 2005 – 2008,byl proto zaměřen výlučně na materiály novošlechtění a zahrnoval prakticky celý rozsah šlechtění nových odrůd bramboru v ČR.
V rámci navrhovaných aktivit řešení projektu byly sledovány rozhodující faktory získání a uchování bezvirových materiálů jako je:-úroveň rezistence kříženců k PVS (ale též k některým dalším devastujícím kmenům virů, např. PVY-N), - komplexní systém laboratorní diagnózy virů ze skleníkových a polních výsadeb, -efektivní převody časných generací kříženců do kultury in vitro a jejich aktivní ozdravování v podmínkách in vitro. - aplikace metod molekulární analýzy, jako podklad pro jednoznačnou identifikaci nových gentypů
Návrat perspektivních kříženců do zkráceného systému množení byl směrován k zajištění bezvirové hlízové produkce pro registrační zkoušky (RZ).
Souběžně s řešením problematiky viru S bramboru probíhal výzkum viru Y bramboruv těchto projektech:
Grantová agentura České republiky 2000 - 2002Název projektu: Molekulární variabilita izolátů viru Y bramboru (PVY)Registrační číslo projektu: 522/00/227Řešitelská pracoviště: Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ústav molekulární biologie rostlin AV ČR České Budějovice
Na tomto úseku probíhala rovněž mezinárodní spolupráce s Francií v rámci projektuBARRANDE
a následně byl řešen projektNAZVQC 1167 Identifikace, diferenciace a charakterizace původců nekróz bramboru virové etiologieŘešitelská pracoviště: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR Č. Budějovice
ÚEB AV ČR Praha Doba řešení: 2001 – 2004Cíl řešení: Vypracování spolehlivé laboratorní diagnostické a diferenciační metody pro viry bramboru přenosné v půdě a nekrogenní izoláty viru Y bramboru (PVY-NTN),včetně ověření citlivosti a vnímavosti odrůd bramboru k infekci a její vliv na kvalitativní parametry.
PMTV TRV
PVY-NTN
cv. Hermes Nadine Nicola Kobra
Největší pozornost byla věnována kmenové diferenciaci PVY, které se staly nejzávažnějším virózou bramboru.
PVY-N
PVY-O
Příznaky infekce PVY narostlinách tabákuN. tabacum cv. Samsun
Organizace génomu PVY-NTN
PVYPVYNN605605P1P1 HC-ProHC-Pro P3P3 CICI NIaNIa NIbNIb CPCP
3’3’ NTRNTR5’5’ NTRNTR
P1P1 HC-ProHC-Pro P3P3 CICI NIaNIa NIbNIb CPCP3’3’ NTRNTRPVYPVYOO-139-1395’5’ NTRNTR
P1P1 HC-ProHC-Pro P3P3 CICI NIaNIa NIbNIb CPCP3’3’ NTRNTRPVYPVYNTNNTN-H-H 5’5’ NTRNTR
PVYN or PVYN- related profilesPVYN or PVYN- related profiles PVYOPVYO or PVYO - related profilesor PVYO - related profiles
CICIP3P3
PVYPVYNN605605
P1P1 HC-ProHC-Pro P3P3 CICI NIaNIa NIbNIb CPCP3’3’5’5’ NTRNTR
P1P1 HC-ProHC-Pro P3P3 CICI NIaNIa NIbNIb CPCP3’3’
PVYPVYOO-139-1395’5’ NTRNTR
Organizace génomu PVY-Wilga
CPCPP3P3 CICI NIaNIa NIbNIb3’3’
PVYPVYNN or PVY or PVYNN- related profiles- related profiles PVYPVYOO or PVY or PVYOO- related profiles- related profiles
P1P1 HC-ProHC-Pro5’5’ NTRNTR
PVYPVYNNW W N242N242
HC-ProHC-Pro
PVYPVYNNWi-PWi-P
CPCPP3P3 CICI NIaNIa NIbNIb3’3’ NTRNTR5’5’ NTRNTR
P1P1
QF 3109 Diferenciace viru S bramboru (PVS) a identifikace karanténně významných izolátů technikami molekulární diagnózy
Plánovaná doba řešení: 2003 – 2007Řešitelé: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR České Budějovice
Cíl řešení: Detailně charakterizovat kmenové spektrum viru S bramboru pomocí biologických, sérologických a nově vyvinutých, ověřených molekulárních metod a postupů. Předat optimalizované diferenciační postupy státní správě k realizaci na úseku fytokarantény.
Příklady aktivit
A01/06 Detekce viru S bramboru (PVS) v materiálech génové banky, tuzemských šlechtitelských materiálech a importované sadběA02/06 Sekvenování fragmentů molekulárního bypassu izolátů PVS-CS a jejich porovnání s genomy PVS-OA03/06 Rozpracování metody molekulární hybridizace pro detekci viru S bramboruA04/06 Diferenciace izolátů PVS na indikátorových rostlinách a molekulárními technikami zaměřenými na vybrané oblasti génomuA05/06 Charakterizace biologických vlastností vybraných izolátů PVS ze skupiny O a CS A06/06 Biolostická infekce směsnými vzorky PVS-CS a PVS-O a vytipování možných rekombinantních klonů.
Výsledky uznávacího řízení sadby v ČR 2000 - 2008
Celkem Zkoušeno Uznáno Sestupněno NeuznánoČR ha % % %
2000 5673 92,4 1,0 6,62001 5178 95,1 0,7 4,22002 5158 78,0 3,2 18,82003 4689 87,8 2,3 9,92004 4933 89,4 3,6 7,02005 4424 88,3 3,2 8,52006 3613 73,8 3,0 23,12007 3831 71,0 5,9 23,22008 3931 74,9 5,0 20,3
Dle údajů ÚKZÚZ
Výskyt virů bramboru ve vzorcích sadby v posklizňových zkouškách (ks pozitivních reakcí ELISA)
Rok V i r u sPLRV PVY PVA PVX/PVM (PVS)
--------------------------------------------------------------------------------------2006
1.148 16.055 25 296 4.466
2007 3.232 15.257 64 254 5.518
--------------------------------------------------------------------------------------
2006 L/Y 7,2%2007 L/Y 21,2%
Podkladové materiály ÚKZÚZ
QH 71123 :Variabilita viru svinutky bramboru (PLRV), zvýšení spolehlivosti jeho detekce a uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění
Plánovaná doba řešení: 1.5. 2007 – 30.12.2011
Cíl řešení: Ověření biologické a molekulární variability izolátů PLRV, zvýšení spolehlivosti jeho laboratorní detekce, identifikace a diferenciace. Studium možností uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění bramboru.
Aktivity :- Doplnění kolekce izolátů PLRV a jejich charakterizace - Biologické vlastnosti izolátů PLRV- Varianty imunologické diagnózy, spolehlivost detekce - Varianty molekulární diagnózy (RT-PCR) a spolehlivost detekce PLRV- Sekvence vybraných úseků genomu PLRV, návrh hybridizačních sond- Příprava binárního vektoru pro transformaci rostlin a transformace vybraných genotypů bramboru.
Detekce izolátů PLRV pomocí RT-PCR(primery dle Solman et al., 2002)
ref 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Z1 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27ref hmotnostní standardZ1 negativní kontrola
1.Izoláty PLRV (1/001 – 1/1/045)
1000 2000 3000 4000 5000 5900
1 2 6 3 7 9 10 11 14 16 17
5R 4R 8R 20R 12R 13R
19R 15R
18R
21
22R
23
24R
26R
25 27 28 29
01
82 5
3
4
6 753
32
Pokrytí genomu PLRV sekvenováním
Návrh binárního vektoru pro transformace bramboru
od roku 2008 se dále podílíme na řešení projektu NAZVQH81262 Riziko zdrojů karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách
Řešitelské pracoviště: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Průhonicea Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.
Plánovaná doba řešení: 2008 – 2011
Cíl řešení:
Zjistit a vyhodnotit nově vzniklá rizika karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách v ČR.
V006: Diagnostika virových onemocnění: - připravit polyklonální protilátky vůči vybraným rekombinantním antigenům kódovaným genomy virových patogenů brambor a testovat jejich využití v diagnostice odpovídajících virových oněmocněníDC6681:Výběr vhodných postupů a syntéza protilátek proti rekombinantním antigenům rostlinných virů.DC6791:Ověření účinnosti protilátek proti rekombinantním antigenům virů bramboru.
V rámci projektu Výzkumné centrum 1M06030(MŠMT)„Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin“Doba řešení 2006-2009řešíme spolu s ÚEB AV ČR v.v.i. Prahavýstup
Participujeme dále na výzkumném projektu Akademie věd ČR 1QS500510558 : Studium výskytu fytopatogenů a jejich genetických variantDoba řešení 2005-2009Řešitelské pracoviště: Biologické centrum AV ČR, v.v.i. České Budějovice
Výzkumný záměr VÚB MSM 6010980701Molekulární a technologické základy produkce kvalitních brambor
• MŠMT (2004-2010)
• Etapa 01: Vývoj, ověření a uplatnění molekulárních metod detekce a kvantifikace vybraných patogenů a genetických struktur u brambor
(q RT-PCR, detekce virů a viroidů (PSTVd), detekce GMO,diagnostické čipy)
NÁVRH PROJEKTU DO VEŘEJNÉ SOUTĚŽE VE VÝZKUMU A VÝVOJI
Programu výzkumu v agrárním sektoru 2007-2012 s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky 2009 - 2011poskytovatel - MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍEvideční číslo projektu - přidělí NAZV
Podací číslo projektu
Vir2
Název projektu
Studium výskytu kmenových skupin a variant viru Y bramboru (PVY) v sadbě bramboru v ČR
VEŘEJNÁ SOUTĚŽ
Programu výzkumu v agrárním sektoru 2007-2012 s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky 2009 - 2011
PODPROGRAM
EFEKTIVNÍ POSTUPY V AGRÁRNÍM SEKTORUVýzkumný směr
Ochrana zdraví rostlin a zvířatCíl projektu
Stanovit frekvenci výskytu kmenů a variant PVY ve šlechtitelských a množitelských materiálech sadby brambor v ČR. Charakterizovat zkoušené odrůdy z hlediska vnímavosti a citlivosti k závažným izolátům nekrotického
charakteru.
Doba řešení
1.1.2009 - 31.12.2011
Výsledek přijímacího řízení: NEPŘIJATO
1.Oponent - 'ANO' 2. Oponent - 'ANO' 2. PROGRAMOVÁ KOMISE 'NE' 3. Mze: NE - projekt nebude financován Smlouva nebude uzavřena.
Identifikace zdrojů virové infekce a jejich eliminace ve šlechtitelských materiálech a sadbě bramboru v ČR
VS8MZEVAK0913 - Programu Výzkum v agrárním komplexu, VAK s počátkem řešení projektů v roce 2009
PODPROGRAM UDRŽITELNÝ ROZVOJ AGRÁRNÍHO SEKTORU
Zlepšit biologický potenciál kulturních organismů a způsoby jeho využívání pro efektivní produkci potravin.
CÍL PROJEKTUDetekce zdrojů virové infekce ve šlechtitelských a sadbových materiálech, charakterizace kmenového spektra PVY a reakce odrůd na infekci novými izoláty, ověření účinných způsobů ozdravení a zvýšení efektivity rezistentního šlechtění pomocí DNA markerů. Datum zahájení řešení1.6.2009 Výsledky projektuExaktní identifikace zdrojů virové infekce v porostech výchozích šlechtitelských materiálů, základní a certifikované sadbě,charakterizace izolátů viru Y bramboru na úrovni kmene resp. varianty, ozdravení infikovaných materiálů pro potřeby bezvirového šlechtění a aplikace MAS pro efektivní výběr nšl. s vyšší úrovní rezistence proti nejzávažnějším patogenům, zejména PVY.
Výsledek
• Projekt nesplnil podmínku podle článku 9 Rámce Společenství pro státní podporu výzkumu, vývoje a inovací (zvláštní pravidla pro zemědělství a rybolov) – projekt využívá výjimku pro zemědělství (uchazeč VÚB jako střední podnik využívá vyjímku s 90% dotace, přitom střední podnik může mít maximálně 75% dotace vč. bonusu), avšak žádný uchazeč nedodal čestné prohlášení o splnění 4 podmínek k výjimce pro zemědělství podle Rámce). Dále upozorňujeme, že v návrhu projektu chybí výstup na rok 2011.
VIROBANKA – shromažďování a udržování izolátů virů in vitro
Národní program konzervace a využívání genofondu mikroorganismů a drobných organismů hospodářského významu. (Dotační titul)
Kolekce izolátů: PLRV-55, PVY-119, PVA-22, PVM-36, PVX-27, PVS-280Dále: PSTVd, PMTV, TRV, PVV, PAMV, PRDV. Evidence na internetu.
Využití:
-Bezprostřednízahájení řešenívýzkumných projektů.Př. :„Kryoterapie…“
-kontrolní izoláty
-mezinárodní výměna
