Postup pro MinION nanopórové sekvenování genomové DNA s...

Výstup projektu IGA: C1_VŠCHT_2019_066 Protokol MinION_SQK-LSK109

Milada Suková, Dana Vejmelková, Sabina Purkrtová

1

Postup pro MinION nanopórové sekvenování

genomové DNA

s využitím ligačně-sekvenačního kitu

(SQK-LSK109)



2

1 Potřebný materiál

o 1 g (nebo 100-200 fmol) genomové DNA pro průtokovou celu R.9.4.1 (v případě

použití fragmentace 100-500 ng genomové DNA) nebo 2 g (200-400 fmol) pro

průtokovou celu typu R10 (skladování průtokových cel: pokojová teplota-1 měsíc

/2–8 °C po 12 týdnů)

o Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002) (skladování: - 20 °C)

FB – Flush buffer

FLT – Flush tether

o Ligačně-sekvenační Kit (SQK-LSK109) (skladování: - 20 °C)

LFB – L fragment buffer

LNB – Ligation buffer

SQB – Sequencing buffer

DCS – DNA control strand

AMX – Adapter mix

SFB – S fragment buffer

EB – Elution buffer

SQT –Sequencing tether - nebude použit

LB – Loading beads

o Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH003) (skladování: - 20 °C)

Wash Solution B

Storage Buffer

2 Další spotřební materiál

o Agencourt AMPure magnetické kuličky (skladování: 2–8 °C)

o NEBNext FFPE Repair Mix (M6630)

NEBNext FFPE DNA Repair Buffer

NEBNext FFPE DNA Repair Mix

o NEBNext Quick Ligation Module (E6056) (skladování: - 20 °C)

Quick T4 DNA Ligase

NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) - nebude použit, ligační

schopnost Adapter Mixu je vyšší pokud je v průběhu experimentu použit

ligační pufr dodávaný jako součást ligačně-sekvenačního kitu

o NEBNext End repair/ dA-tailing Module (E7546) (skladování: - 20 °C)

NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer

NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix



3

o 1,5 ml zkumavky Eppendorf DNA LoBind

o 0,2 ml tenkostěnné PCR zkumavky

o voda bez nukleasové aktivity (ThermoFisher, AM9937)

o čerstvě připravený 70% ethanol ve vodě bez nukleasové aktivity

3 Přístrojové vybavení

o Hula rotátor

o Mikrocentrifuga

o Termocyklér

o Pipety s rozsahem 1000, 100 a 10 l

o Časovač

o Vortex

o Magnetický separátor (stojánek) vhodný pro 1,5 ml zkumavky Eppendorf

o Box s ledem

o MinION zařízení (skladování: pokojová teplota)

o Počítač/notebook připojený k internetu



4

4 Příprava knihovny

4.1 Oprava DNA a příprava konců (35 min)

Materiál:

o 1 g (nebo 100-200 fmol) gDNA

o DNA CS (= control strand DNA) – součást balení ligačně-sekvenačního kitu

o 0,2 ml tenkostěnné PCR zkumavky

o voda bez nukleasové aktivity

o NEBNext End repair/dA-tailing model (E7546)

o čerstvě připravený 70% ethanol ve vodě bez nukleasové aktivity


o NEBNext FFPE Repair Mix (M6630)

o Agencourt AMPure magnetické kuličky

Postup:

Prvním krokem je rozmražení DNA CS při pokojové teplotě, DNA odstřeďte při

2000 RPM po dobu 30 s, promíchejte pipetováním a umístěte na led

Činidla NEBNext FFPE DNA Repair Mix a NEBNext End repair/ dA-tailing Module

stočte při 2000 RPM po dobu 15 s a umístěna na led, pokud výrobce neuvádí jinak

Připravte DNA ve vodě bez nukleasové aktivity:

o Přeneste 1 g (nebo 100-200 fmol) genomové DNA do DNA LoBind zkumavky

(2 g či 200-400 fmol pokud se sekvenuje na průtokové cele R10)

o Objem upravte na 49 l s využitím vody bez nukleasové aktivity



5

o Obsah zkumavky důkladně promíchejte převracením či cvrnkáním (vyhnutí

nechtěným zlomům DNA)

o Zkumavku odstřeďte v mikrocentrifuze při 2000 RPM po dobu 15 s

V 0,2 ml tenkostěnné epince smíchejte následující:

Činidlo Objem l

DNA 47

DNA CS 1

NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 3,5

NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2

Ultra II End-prep reaction buffer 3,5

Ultra II End-prep enzyme mix 3

Celkový objem 60

Obsah zkumavky jemně promíchejte a odstřeďte

Pomocí termocykléru inkubujte při 20 C po dobu 5 min a při 65 C po dobu 5 min

Přeneste vzorek DNA do čisté 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind epinky

Připravte kuličky AMPure XP k použití: resuspendovat pomocí vortexu těsně před

použitím

Přidejte 60 l resuspendovaných AMPure XP do reakce a epinku promíchejte

Inkubujte na Hula rotátoru (50 RPM) po dobu 5 min při pokojové teplotě



6

Připravte 500 l čerstvého 70 % ethanolu ve vodě bez nukleasové aktivity

Vzorek stočte (2000 RPM, 15 s) a vložte na magnet. Zkumavku držte na magnetu do té

doby, dokud nedojde k vytvoření pelety, poté odstraňte supernatant

Zkumavku stále držte na magnetu a promývejte kuličky 200 l čerstvě připraveného

70 % ethanolu bez porušení pelety. Poté ethanol pomocí pipety odstraňte

Opakujte předešlý krok

Vzorek odstřeďte (2000 RPM, 15 s) a epinku vložte zpět na magnet, pipetujte zbytky

ethanolu, peletu ponechejte schnout po dobu 30 s, avšak zabraňte praskání pelety

Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a resuspendujte peletu v 61 l vody bez

nukleasové aktivity. Inkubujte 2 min při pokojové teplotě

Vzorek vraťte do magnetického stojanu a držte vzorek na magnetu, dokud není eluát

čirý a bezbarvý

Odstraňte a uchovejte 61 l eluátu v čisté 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind zkumavce

V tomto okamžiku je možno vzorek skladovat při 4 C přes noc či pokračovat dále

v experimentu.



7

4.2 Ligace adaptérů a čistění (30 min)

Materiál:

o Adapter Mix (AMX)

o Long Fragment Buffer (LFB)

o Elution Buffer (EB)

o Ligation Buffer (LNB)

o Short Fragment Buffer (SFB)

o NEBNext Quick Ligation Module (E6056)

o Agencourt AMPure XP kuličky


Postup:

Adapter Mix (AMX) a Quick T4 ligasu odstřeďte (2000 RPM, 15 s) a vložte na led

Rozmrazte ligační pufr (LNB) při pokojové teplotě, odstřeďte (2000 RPM, 15 s) a

promíchejte pipetováním. Kvůli viskozitě tohoto pufru je vortexování neúčinné. Ihned

po rozmrazení a promíchání vložte pufr na led.

To samé proveďte s elučním pufrem (EB)

Pro obohacení DNA fragmentů o velikosti 3 kb nebo delších, rozmrazte jednu

zkumavku Long Fragment Buffer při pokojové teplotě, promíchejte vortexováním,

krátce stočte (2000 RPM, 15 s) a uložte na led

Pro zachování fragmentů všech délek rozmrazte jednu zkumavku fragmentačního pufru

(SFB) při pokojové teplotě, promíchejte vortexováním, odstřeďte a vložte na led

V 1,5 ml Eppedorf DNA LoBind zkumavce smíchejte následující reagencie:

Činidlo Objem l

Vzorek DNA z předchozího kroku 60

Ligační pufr (LNB) 25

NEBNext Quick T4 DNA ligasa 10

Adapter Mix (AMX) 5

Celkem 100

Směs jemně promíchejte zatřepáním zkumavkou a odstřeďte

Směs inkubujte po dobu 10 min při pokojové teplotě



8

Připravte kuličky AMPure XP k použití: resuspendovat pomocí vortexu

Do reakce přidejte 40 l resuspendovaných AMPure XP kuliček a promíchejte

zatřepáním zkumavkou

Inkubujte na Hula rotátoru (70 RPM) po dobu 5 min při pokojové teplotě

Vzorek odstřeďte (2000 RPM, 5 s) a vložte na magnet. Zkumavku držte na magnetu do

té doby, dokud nedojde k vytvoření pelety, poté odstraňte supernatant

Kuličky se promyjí přidáním 250 l Long Fragment Buffer (LFB) nebo přidáním Short

Fragment Buffer (SFB), promíchejte kuličky resuspendací, poté vraťte zkumavku na

magnetický stojan a nechte kuličky peletovat, poté odstraňte supernatant pomocí pipety

Opakujte předchozí krok

Vzorek odstřeďte a zkumavku vložte zpět na magnet. Odstraňte zbytky supernatantu

Nechte schnout po dobu 30 s, avšak zabraňte praskání pelety

Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a resuspendujte peletu v 15 l elučního

pufru (EB). Inkubujte 10 min při pokojové teplotě. U DNA s vysokou molekulovou

hmotností může inkubace při 37 C zlepšit regeneraci dlouhých fragmentů.

Peletujte kuličky na magnetu, dokud není eluát čirý a bezbarvý

Přeneste 15 l eluátu do čisté 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind zkumavky (= eluát

obsahující knihovnu DNA, nutno odstranit kuličky)

Kvantifikujte 1 l eluovaného vzorku pomocí fluorometru (př. Qubit)

Knihovnu je nutno skladovat na ledu, dokud není připravena k načtení



9

5 Nanášení vzorku na průtokovou celu (10 min)

Materiál:

o Flush Tether (FLT)

o Loading Beads (LB)

o Flush Buffer (FB)

o Sequencing Buffer (SQB)


o Voda bez nukleasové aktivity

Postup:

Rozmrazte Sequencing Buffer (SQB), Loading Beads (LB), Flush Tether (FLT) a jednu

zkumavku Flush Buffer (FB) při pokojové teplotě, ve chvíli kdy dojde k rozmražení

umístit na led

Sekvenační pufr (SQB) a Flush pufr (FB) promíchejte vortexováním, odstřeďte a vraťte

na led

Flush Tether (FLT) promíchejte pipetováním a vraťte na led

Zapojení průtokové cely

o Otevřete software MinKNOW a připojte počítač k internetové síti.

o Připojte k zařízení MinION USB kabel a zapojte ho do PC.

o Pro načtení všech informací o průtokové cele je nutno zkontrolovat hardware

(Check the Hardware – Start Test)

o Vyberte typ cely (MinION Starter Pack – FLO-MIN106)

o Zaškrtněte příkaz „Jump to run“

Kontrola průtokové cely (není nutná pro započetí experimentu, ale umožňuje kontrolu

funkčnosti průtokové cely před nanesením vzorku):

o Spusťte příkaz "Check flow cells" a poté „Start“.

o Tři možné výstupy testu: žlutý otazník – kontrola průtokové cely neproběhla,

zelený zaškrtávací znak – počet sekvenační pórů je dostatečný, žlutý zaškrtávací

znak – počet sekvenačních pórů je nedostatečný

Otevřete víko sekvenačního zařízení nanopore a posuňte kryt plnícího otvoru průtokové

buňky ve směru hodinových ručiček, tak aby bylo viditelný plnící port (knihovna se



10

načítá po kapkách, aniž by byl pipetovací hrot pevně zasunut do portu, během

pipetování se vyvarujte přívodu vzduchu, póry musí být zakryty pufrem, odstraněním

více než 20-30 l hrozí ztráta sekvenačních kanálů)

Po otevření plnícího otvoru zkontrolujte, zda pod krytem nejsou malé bublinky. Pokud

jsou bublinky přítomné, odstraňte malý objem pufru (několik l) společně s bublinami:

o Nastavte 200 l na pipetě, zasuňte špičku do plnícího otvoru, otáčejte kolečkem,

dokud číselník nezobrazí 220-230 l, nebo dokud neuvidíte malý objem pufru

vstupující do špičky pipety

o Vizuálně zkontrolujte, zda pufr přechází od nanášecího portu k senzorovému

poli

Připravte směs pro plnění průtokové cely: přidejte 30 l rozmrazeného a promíchaného

Flush Tether (FLT) přímo do zkumavky rozmrazeného a promíchaného Flush pufru

(FB) a promíchejte pipetováním nahoru a dolu

Naneste 800 l směsi pro plnění do průtokové cely přes plnící port, aby se zabránilo

zavádění vzduchových bublin. Počkejte 5 min

Pipetováním promíchejte důkladně obsah Loading Beads (LB) (tato zkumavka obsahuje

suspenzi kuliček, které se velmi rychle usazují, je proto nutné, aby byly promíchány

těsně před použitím)

Plnící otvor Odpadní port 1 Odpadní port 2

Odpadní kanál Senzorové pole

Kryt vzorkovacího portu (Vzorkovací port SpotON)



11

V nové zkumavce připravte knihovnu k načtení následujícím způsobem:

Činidlo Objem l

Sequencing Buffer (SQB) 37,5

Loading Beads (LB), těsně před použitím

promíchat 25,5

DNA knihovna 12

Celkem 75

Dokončete aktivaci průtokové cely:

o Jemným zvednutím krytu vzorkovacího portu SpotON zpřístupníte vzorkovací

port SpotON

o Naneste dalších 200 l směsi pro plnění do průtokové cely přes plnící otvor

(nikoliv vzorkovací port SpotON), abyste zabránili vniknutí vzduchových

bublin

Připravenou knihovnu těsně před nanášením jemně promíchejte pipetováním nahoru a

dolu

Po kapkách přidávejte 75 l vzorku do průtokové cely skrze vzorkovací port SpotON.

Než přidáte další kapku, ujistěte se, že každá kapka proudí do portu.

Opatrně nasaďte kryt vzorkovacího portu SpotON a ujistěte se, že zátka vstupuje do

SpotON portu, zavřete plnící port a nasaďte víčko MINION



12

6 Spuštění analýzy

o Spusťe příkaz „New experiment“.

o Zadejte název experimentu a případně upravte nastavení (např. typ basecalling-defaultní

nastavení: FAST)

o Spusťte „Start run“.

o Pro on-line vyhodnocování výsledků spusťte program EPI2ME a vyberte typ analýzy,

dále nadefinujte jednotlivé parametry analýzy dle pokynů na obrazovce a spusťte

„Run“.

7 Ukončení analýzy

o Měření ukončete „Stop running“. V případě, že basecalling probíhá v reálném čase

(doporučeno), jej nechte doběhnout.

o Po přípravě materiálu na propláchnutí průtokové cely, odpojte kabel USB se zařízením

MinION z PC a též ze samotného zařízení.



13

8 Propláchnutí průtokové cely

Materiál:

Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH003)

Wash Solution A

Wash Solution B

Storage Buffer

Postup:

Zkumavku promývacího roztoku A vložte na led. Zkumavku nevortexujte

Rozmrazte jednu zkumavku promývacího roztoku B při pokojové teplotě

Obsah promývacího roztoku B důkladně promíchejte vortexováním, krátce odstřeďte a

vložte na led

V čisté 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind připravte následující promývací směs:

Složky Objem l

Wash Solution A (A) 20

WAsh Solution B (B) 380

Tuto směs dobře promíchejte pipetováním a vložte na led. Zkumavku nevortexujte

Zastavte nebo pozastavte sekvenační experiment v MinKNOW a ponechte průtokovou

buňku v zařízení

Ujistěte se, že kryt plnícího portu a kryt vzorkového portu SpotON jsou v pozicích

uvedených na obrázku níže:






14

Pomocí pipety P1000 nasajte veškerou tekutinu z odpadního kanálu přes odpadní port

1. Plnící port a vzorkovací port SpotON jsou uzavřeny, žádná kapalina by neměla

opustit oblast pole senzorů.

Otočte kryt plnícího otvoru průtokové cely ve směru hodinových ručiček, tak aby byl

viditelný plnící port.

Zkontrolujte, zda mezi vstupním otvorem a sadou senzorů není vzduch:

o Nastavte 200 l na pipetě, zasuňte špičku do plnícího otvoru, otáčejte kolečkem,

dokud číselník nezobrazí 220-230 l, nebo dokud neuvidíte malý objem pufru

vstupující do špičky pipety


poli

o Pole pórů musí být vždy zakryto pufrem. Odstraněním více než 20-30 l hrozí

ztráta sekvenačních kanálů

Pipetujte 400 l připravené promývací směsi do průtokové cely přes plnící otvor bez

zavádění vzduchu.

Zavřete plnící port a počkejte 30 minut

Ujistěte se, že kryt plnícího portu a kryt vzorkového portu SpotON jsou v pozicích

uvedených na obrázku níže:

Pomocí pipety P1000 nasajte veškerou tekutinu z odpadního kanálu přes odpadní port.

Vstupní port a vzorkovací port SpotON jsou uzavřeny, žádná kapalina by neměla opustit

oblast pole senzorů.






15

V tuto chvíli může být na průtokovou celu nanesena další knihovna či uchováme celu pro

další měření dle následujícího postupu

9 Uchování průtokové cely pro další měření

Rozmrazte jednu zkumavku zásobního pufru (Storage Buffer) (S) při pokojové teplotě.

Obsah pipetou důkladně promíchejte a krátce odstřeďte

Otočte kryt plnícího otvoru průtokové buňky ve směru hodinových ručiček, tak aby byl

viditelný plnící port

Zkontrolujte, zda mezi vstupním otvorem a sadou senzorů není vzduch. V případě

potřeby odsajte pomocí pipety (1000 µl) malý objem, abyste odstranili veškerý vzduch:

o Nastavte 200 l na pipetě (1000 µl), zasuňte špičku do plnícího otvoru, otáčejte

kolečkem, dokud číselník nezobrazí 220-230 l, nebo dokud neuvidíte malý

objem pufru vstupující do špičky pipety


poli

Pomalu přidávejte 500 l Storage pufru (S) přes plnící port průtokové cely. Poté port

uzavřete

Pomocí pipety (P1000) nasávejte veškerou tekutinu z odpadního kanálu před odpadní

port 1. Plnící port i SpotON jsou uzavřeny. Žádná kapalina by neměla opustit oblast

pole senzorů.

Průtoková cela může nyní být uložena při 4 C – 8 C. Pro její uložení do ochranného

obalu se řiďte pokyny výrobce dodávanými spolu s celou

Pokud chcete průtokovou celu znovu použít, vyjměte ji z uložiště a nechte ji zahřát na

pokojovou teplotu po dobu 5 minut



16

10 Literatura

(viz https://nanoporetech.com/)

experiment-companion-minknow-MKE_1013_v1_revAY_11Apr2016-any

minion-mk1c-protocol-MKC_2005_v1_revA_27Nov2019-any

gDNA-sqk-lsk109-GDE_9063_v109_revQ_14Aug2019-minion

input-dna-rna-qc-IDI_S1006_v1_revB_18Apr2016

flow-cell-wash-kit-protocol-WFC_9088_v1_revB_18Sep2019-any

Date post:	08-Nov-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

Postup pro MinION nanopórové sekvenování genomové DNA s...

Documents