12.6.2019

1

Mikrobiologie

Mikrobiologie

Katedra potravinářských biotechnologií a kvality z.produktů

Mikrobiologiemíkros bios logos

mikroorganismy (mikroby)

- pozorování mikroskopem - všudypřítomné (ubikvitární)- velmi rozmanité- původci nemocí (patogenní m.) – cca 3 %- většina je nepatogenní – řada s významným užitkem pro člověka

Význam

• produkce O2 (více než 50 %)

• rozklad org.hmoty, koloběhy prvků

• mikrobiota lidí, zvířat, rostlin

• výroba potravin

• výroba léčiv

12.6.2019

2

Nebuněčné formy života a buněčné organismy (pro- a eukaryotické)

Nebuněčné formy života

Viry, viroidy, priony

Není buněčný typ organizace

Onemocnění

Závislost na živé buňce

Viry

• DNA nebo RNA (= genom viru) obalená bílkovinným pláštěm (kapsidou) =

nukleokapsida

• rozlišení dle NK = DNA a RNA viry• dle hostitele na bakteriální (bakteriofágy), rostlinné, hub, živočišné

(bezobratlí, obratlovci)

• submikroskopické – nm (= 10-9 m)

12.6.2019

3

Viroidy

• objeveny 1971 Th. Dienerem

• jednořetězcová RNA bez proteinového pláště (asi 240-360

nukleotidů)

• nekóduje žádný protein (x viru)

• lokalizace – v jádře h.buňky

• přenos – šťávou, roubováním

• onemocnění rostlin (zakrslost, deformace listů)

• dosud 36 viroidů

• viroid vřetenovitosti hlíz brambor, viroid zakrslosti chmele aj.

Priony

• proteinová částice bez NK

• postihují nervové buňky

• změna normálního proteinu (PrPC) = α-helix – v prionový (PrPSc) = β-skládaný list

rozpustný ve vodě, štěpitelný proteázami nerozpustný ve vodě, není štěpitelný proteázami

12.6.2019

4

• smrtelné neurodegenerativní choroby

• u lidí – např. kuru, Creutzfeld-Jacob,

• u zvířat – např. scrapie (klusavka), bovinní spongiformní encefalopatie

(„nemoc šílených krav“)

• vzácná on.

• projevy: ztráta motorických funkcí, změny osobnosti, zmatenost, nespavost,

demence

NC v oblasti fyziologie a medicíny

1976 – Daniel Carleton Gajdusek – výzkum kuru

1997 – Stanley Prusiner –

výzkum prionů

12.6.2019

5

Veškerý buněčný život na Zemi je zahrnut ve 3 doménách

prokaryotické organismy

Buněčné organismy

Prokaryotické

• jednobuněčné organismy s jadernou hmotou bez membrány

Doména Archaea

• výskyt v extrémních podmínkách – extrémofilové• buněčná stěna obsahuje pseudomurein, ale neobsahuje

peptidoglykan (murein)

Doména Bacteria

• člení se dle charakteru buněčné stěny – grampozitivní,

gramnegativní a bez buněčné stěny (mykoplazmata)

• buněčná stěna obsahuje peptidoglykan

Buněčné organismy

Eukaryotické

• jedno nebo více jader s membránou

• Houby (Fungi)

• Řasy (Algae)

• Prvoci (Protozoa)

----------------------------------

• (Animalia a Plantae)

12.6.2019

6

CHARAKTERISTIKA PROKARYOTA EUKARYOTA

BACTERIA ARCHEA

Velikost (µm) 0,5-10 0,5-5 10-100

Jaderná membrána ne ano

Organely ne ano

Vnitřní uspořádání jednoduché složité

Buněčná stěna murein pseudomurein variabilní

Počet chromozómů 1 kruhový

(1 kopie každého genu – haploidní)

více lineárních

(2 kopie každého genu

– diploidní)

Ribozómy 70 S 80 S

Některé rozdíly mezi prokaryotickou a eukaryotickou buňkou

Stavba bakteriální buňky

Leenwenhoekův mikroskop

…a jeho nástupci

12.6.2019

7

Velikost bakterií• v µm• rozpětí 0,2 – (1x2) - 750 µm

• Mycoplasma pneumoniae 0,2 µm

• Escherichia coli 1x2 µm

• Thiomargarita namibiensis 750 µm

80 x 600 µm

Rickettsia prowazeki 0,2 µm

Tvarová rozmanitost bakterií

Různé způsoby USPOŘÁDÁNÍ bakteriálních buněk

diplokok

streptokok

sarcina

stafylokok

kok

12.6.2019

8

pleomorfní (mnohotvárné)

bakterie

Tvorba endospor (Bacillus sp.), cyst,

heterocyst (Azotobacter sp.) apod.

Proč mají bakterie určitý tvar?

fyziologická adaptace

Vznik vláknitých forem – př. Actinomyces israelii – absence P, cysteinu, glutathionu

Dimorfismus v životním cyklu Caulobacter crescentus

12.6.2019

9

Co chtějí?

základy života na Zemi

Buněčná stěna bakterií

mechanická role - ochrana

stálý tvar

vyrovnává osmotický tlak antigenní role

je místem působení některých antibiotikdiagnostická role: barví se Gramovým barvením

Organismy v doméně Bacteria se rozlišují:

G+ bakterie s buněčnou stěnou

G- bakterie s buněčnou stěnou

bakterie bez buněčné stěny

Hans Christian Gram – na konci 19.st. vyvinul barvení,

později „metoda dle Grama“ či „Gramovo barvení“

Teprve v roce 1963 popsal M. R. J. Salton princip tohoto

barvení (viz dále)(1853 – 1938)

12.6.2019

10

NAM NAG NAM

NAM NAGNAG

Základem jsou dva sacharidy –

N-acetylglukosamin a kyselina N-acetylmuramovápropojené beta-1,4 glykosidickými vazbami do vláken – ta jsou k sobě

spojena pomocí řetízků tetrapeptidů

NAMNAG

Glykosidické vazby – štěpí je lysozym

Významnou složkou BS bakterií je peptidoglykan (murein)

NAM NAG

K. teichoová K. lipoteichoová

Zástupci: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Clostridium,

Bacillus aj.

Buněčná stěna GRAMPOZITIVNÍHO typu

Cytoplazmatická membránatransmembránovýprotein

peptidoglykan(20-80 nm)

90 % BS

NAM NAG

Buněčná stěna GRAMNEGATIVNÍHO typu

Cytoplazmatická membrána

VNĚJŠÍ membrána

porin

lipoproteiny

LIPOPOLYSACHARID = LPS

enzymy

PERIPLAZMATICKÝ PROSTOR(periplasma – gelová

konzistence)

biomembrána

10 % BSpeptidoglykan

chemoreceptory

12.6.2019

11

BARVENÍ PODLE GRAMA

• na odlišné stavbě a složení BS bakterií je založeno

• diferencuje bakterie do dvou skupin – G+ a G-

LIPOPOLYSACHARID = LPS u G- bakterií

O-antigen

Core polysacharid

Lipid AVNĚJŠÍ membrána

• Polysacharidová část - antigenní schopnost

• Lipidová část = lipid A (endotoxin) – toxicita G-

poutá LPS do vnější membrány

• pouze u G- bakterií• nejprozkoumanější u salmonel

LPS patří mezi nejtoxičtější mikr. produktyhorečka, ovlivnění bílých krvinek

G+ G-

barva po obarvení dle Grama Modrá/fialová Červená/růžová

peptidoglykan v buněčné stěně Silná vrstva Tenká vrstva

teichoová a lipoteichoová kyselina v buněčné stěně

+ -

lipopolysacharid v buněčné stěně - +

Rozdíly mezi G+ a G- bakteriemi - shrnutí

12.6.2019

12

Bakterie BEZ buněčné stěny

• přirozeně – mykoplazmata

nesyntetizují peptidoglykan

nejmenší bakterie (0,2 µm)

původci onemocnění plic

• ztráta během života = tzv. L-formy bakteriítj. za normálních okolností BS mají, ale mohou o ni přijít

L-formy bakterií (CWD bacteria – cell wall-deficient)

1935 – Lister institute (Londýn) – „L“• pouze bakterie, které za normálních podmínek BS mají a ztratily ji během

života (působení různých faktorů)

• vzhled – BS určuje tvar – u L-forem odlišný proti původnímu

• získání L forem možné - in vitro inhibicí syntézy peptidoglykanu (antibiotika)

nebo jeho degradace (lysozym)

Bacillus subtilis (s BS) Bacillus subtilis L-formy

L-formy bakterií (CWD bacteria – cell wall-deficient)

• význam: rezistence k antibiotikům, k imunitnímu systému hostitele (přežívání

ve fagocytech)

• možná příčina chronických či recidivujících chorob ?

12.6.2019

13

Cytoplazmatická membrána

• tenká (cca 6-8 nm) bariéra

• odděluje cytoplazmu od okolí

• nezbytná • selektivní permeabilní bariéra

• základní struktura – dvojvrstva

fosfolipidů: hydrofobní (MK) a

hydrofilní (glycerolfosfát) složka

• vnořeny membránové proteiny –transportní funkce

• CM má tekutý charakter

Hydrofobní oblast

Hydrofilní oblast

Hydrofilní oblast

V elektronovém mikroskopu:

CYTOPLAZMA

Cytoplazmatická membrána

Hopanoidy

• specifické lipidové látky v CM někt.zástupců Bacteria

• zesilují CM

• adaptace na extrémní podmínky prostředí – vysoká t, nízké pH, vysoká

koncentrace někt.látek aj.

• např. u Zymomonas mobilis (hopanoidy tvoří až 50 % z lipidů) – ochrana

před působením vysoké koncentrace etanolu

Klíčové funkce CM pro buňku

• izoluje (hydrofobní zóna), zároveň je propustná• ukotvení mnoha významných proteinů (např. enzymy katalyzující

bioenergetické reakce)

• přeměna energie – respirační řetězec – vzniká zde tzv. protonový gradient

H+ poháněná síla zajišťuje

fungování mnoha na energii

závislých činností

transport

pohyb

biosyntéza ATP

12.6.2019

14

Povrchové struktury

• jen u některých nebo jen v určitém prostředí

• produkce slizových či lepivých látek na

buněčném povrchu

• složení – polysacharidy, proteiny

• pouzdro (kapsula) – rigidní, těsně na BS

• slizová vrstva (slime layer) – deformovatelná,

volně připojená

Funkce těchto struktur:

• přilnutí (adheze) k povrchům:

patogenní b. – průnik

• formování biofilmu• váží vodu – zabraňují vyschnutí

• zásoba některých živin• shromažďování odpadních látek

• ochrana před imunitním systémem

(„maskování“ - obtížné rozpoznání, fagocytóza)

• zodpovídají za patogenitu (škodlivost)

některých bakterií např. pouzdro u

Streptococcus pneumoniae

Fimbrie a pili

• vláknité struktury bílkovinného charakteru, vyčnívají z povrchu buňky

Fimbrie

• adheze k povrchu

• formování pelikul

• formování biofilmů

• fimbrie při infekčním procesu využívá např. Salmonella sp.

12.6.2019

15

Pili• delší

• většinou 1

• výměna genet.materiálu - konjugace(donorová a recipientní bakterie)

• adheze patogenních bakterií

Pili IV typuadheze

tzv. twitching motility – typ klouzavého pohybu (viz dále) např. u rodu

Pseudomonas

Biofilmspolečenství mikroorganismů obalené extracelulární polymerní matrix

(tvořeno hlavně z polysacharidů; slizová hmota)

tvoří se na povrchu neživých i živých povrchů

Pro bakterie zajišťuje:

výživu: v matrix – kanálky (voda, živiny)

ochranu

Vznik biofilmu

1. volné (planktonické) bakterie – 2. přilnutí k podkladu (dostatek živin) – 3.syntéza a uvolňování polysacharidů do prostředí = hlenová matrix - 4. dělení

Quorum sensing = způsob komunikace MO v biofilmu - chem.signály (různé

molekuly) – zjišťují hustotu populace, je-li příliš hustá – (5.) část buněk se

uvolní a vytvoří biofilm na jiném místě (kolonizace) – brání se zhuštění

populace

12.6.2019

16

K.K.Jefferson, 2004

Proč bakterie (ale i jiné mikroorganismy) tvo ří biofilmy?

Odolnost vůči

dezinfekčním l.,

antibiotikům,

imunitnímu

systému,

pH, vyschnutí

aj.

buňky v biofilmu – vyšší metabolická aktivita –využití např. při čištění odpadních vod

Mechanismus,

jak zůstat ve

výhodné oblasti(např. v

lidském/zvířecím

těle)

Kde se tvoří biofilmy?

- méně dostupná místa ve výrobnách (např. v potravinářství)

kolena, záhyby, rýhy, těsnění aj.

- hrubé povrchy (X hladké povrchy – menší adheze)

Zubní biofilm

je prospěšný – umožňuje přilnutí

běžným MO dutiny ústní

nesmí být přerostlý – čištění zubů a

omezení sacharidů ve stravě

12.6.2019

17

Nejnovější probiotika – 4. generace = biofilmová p.

ZDROJ:http://www.pharmabiotech.cz

Biofilmy lze i vhodně využít – např.:

Na povrchu střevní sliznice (i dalších površích) vytváří mikroorganismy biofilmy

implantáty

chirurg.pomůcky

oční čočky

Biofilmové infekce

Antibiofilmové strategie

1. Prevence vzniku biofilmu

2. Odstranění již vytvořeného biofilmu

12.6.2019

18

Buněčné inkluze

• časté

Zásoba C • při nadbytku syntetizovány – zdroj stavebních l., E

Zásoba P • P – často limitující živinou v prostředí – tvorba zásob = výhoda

• k syntéze NK, fosfolipidů, ATP

Magnetozómy• částice magnetitu (Fe3 O4)

• magnetotaxis – orientace v magnetickém poli Země

Plynové vesikuly

• u mnoha zástupců Bacteria i Archea

• vřetenovité útvary

• počet od několika po několik set/buňku

• umožňují pohyb ve vodním sloupci

• udržení na vodní hladině – hl. fototrofní

org. = optimální intenzita světla (sinice –

tvorba „květů“ na vodních hladinách)

Endospory

vegetativní buňka

klidová (dormantní) buňka

nepříznivé podmínky

= =

SPORULACE(hodiny)

vegetativní buňka

určitý impuls

= =

GERMINACE(minuty)

12.6.2019

19

Struktura endosporyvýrazně odlišná od veget.b. – zejména mnoho vrstev a specifické sloučeniny

Exosporiumproteinový obalcoat (plášť) – vrstvy pro sporu

specifických proteinů

Cortex (kůra) – vrstvy

peptidoglykanů

Core („dřeň“) – obaleno

buněčnou stěnou,

cytoplazm.m., uvnitř

cytoplazma, nukleoid atd.

naprosto specifická – kyselina dipikolinová – jen u

dormantní b. ve „dřeni“

Vysoký obsah Ca 2+ - tvoří komplex s k.dipikolinovou (chelát)

– cca 10 % hmoty endospory

vazba volné vody=

resistence makromolekulinaktivace enzymů

vegetativní

buňkaZdvojení a rozdělení

chromozomu

Buňka rozdělena na sporangium a

presporu

Sporangium pohlcuje presporu

Sporangium syntetizuje

obalové vrstvy spory

Vznik kůry a pláště spory

Dozrání spory

Lýza sporangia, uvolnění spory

Germinace, uvolnění

veg.b.

Charakteristika spor

• extrémní odolnost – t, pH, UV a jiná záření, vyschnutí, chemické látky

• téměř nulový metabolismus• vysoká životaschopnost• nesnadné barvení

Vegetativní buňka - 70°C Spora Clostridium tetani 100°C 90 min Cl.botulinum až 5 hodin

Spolehlivá likvidace – autoklávování (121°C 2 atm, 20 min)

12.6.2019

20

Jak dlouho přežívají?

• spolehlivě se ví – několik dekád• Některé dokonce i několik tisíciletí • věk endospor může limitovat řada faktorů – hlavní – kosmické záření

(kumulativní efekt v čase)…. mohou však být chráněny ..

• stovky miliónů let…

Rozdíly mezi vegetativní a dormantní buňkou

charakteristika vegetativní dormantní

Obsah vápníku nízký vysoký

Dipikolinová kys. - +

Enzymatická aktivita vysoká nízká

Úroveň respirace vysoká nízká či chybí

Syntetická aktivita + -

Odolnost k t nízká vysoká

Odolnost k záření nízká vysoká

Odolnost k chemikáliím

nízká vysoká

lysozym citlivost rezistence

Obsah vody vysoký (80-90 %) nízký (10-25 %)

Morfologie bakteriálních spor (tvar, velikost a umístění)

terminální

(Clostridium paraputrificum)

subterminální

(Clostridium botulinum)

centrální

(Clostridium novyi)

12.6.2019

21

Pohyb bakterií plaváním a klouzáním

Bičík (flagellum, pl. flagella) – plavání

• pomocí rotace („lodní šroub“) tlačí/táhne buňku tekutým

prostředím

• tenký 15-20 nm

vlákno

hák

motor bičíku složen z:

2 - Systému prstenců

1 - Centrální osy

3 – motorických proteinů

32

1

12.6.2019

22

Pohyb pomocí bičíku:

Bičík = malý rotační motor:

• Rotor = centrální osa a prstence

• Stator = motorické proteiny – otáčí

c.osou a prstenci – - - točivý

moment – na vlákno - - - pohyb

Energie – protonový gradient – protony

skrz kanálky v Mot proteinech

cca 1000 protonů na rotaci

Rychlost pohybu:

- bičík nerotuje konstantní rychlostí – zvyšuje/snižuje se dle síly

proton.gradientu

- až 300 otáček/sec - až 60 buněčných délek/sec

Klouzavý pohyb bakterií (gliding motility)

• pohyb po pevném podkladu

• proti plavání – pomalejší a hladší styl

• rychlost cca 10 µm/sec

• různé mechanismy tohoto pohybu

• Př. sinice – produkce polysachar.slizu na vnějším povrchu buňky

• „twitching motility“ – pili IV typu – opakuje se prodloužení a retrakce pilů –

táhne bakterii za sebou

Mikrobiální taxe

Chemotaxe• Absence chem.gradientu:

náhodný pohyb – vpřed („běh“) a

následuje prudké „zastavení“ a změna

směru („kotrmelec, otočka“) - opět

náhodný

• Přítomnost atraktantu (repelentu)

cílený pohyb „runs“ jsou delší a „zastavení“ méně

časté

Bakterie se pohybují ve směru k

atraktantu či od repelentu

• vnímáno řadou membránových

proteinů (chemoreceptory) – váží

chem.l.

• jakýsi senzorický systém bakterií

(analogie se smyslovým vnímáním

NS zvířat)