Metody s využitím reakce antigen-protilátka

Metody s využitím reakce antigen - protilátka

Neznačený antigen/protilátka• Precipitace• AglutinaceZnačený antigen/protilátka• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)• Radioimmunoassay (RIA)• Western blotting• Immunofluorescence• Průtoková cytometrie

Význam metod a hodnocení

• Důkaz přítomnosti antigenu• Důkaz přítomnosti protilátky

• Kvalitativní hodnocení – pozitivní x negat.• Vznik zákalu, precipitátu, aglutinace• Kvantitativní hodnocení – měření vzniklých

IK

Sensitivita metod

precipitace - 30 g/ml

aglutinace - 1 g/ml

radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml

Precipitation reactionAgregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních makromolekulárních antigenů

Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky.

Precipitační reakce

Ab + solubilní Ag Síť antigenů a protilátek Precipitace

•Radiální imunodifúze •Dvojitá difúze•Imunoelektroforéza

Stanovení imunoprecipitace:vizuálně metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení)

MetodyFlokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavceImunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu

Radiální imunodifúze – jednoduchá, dvojitá

Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek

Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů

Vyhodnocení RID• podle MANCINIOVÉ, precipitace se měří po skončení

imunodifúze (48 až 72 hodin)• průměr prstence je přímo úměrný koncentraci Ag• pokud není precipitace ukončená, vzniká křivka• Stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, albuminu,

alfa1-antitrypsinu, ceruloplasminu, alfa 2-makroglobulinu, transferinu, C1 inhibitoru

Dvojitá difúze (podle Ouchterlonyho)

Identické Neidentické Částečně identické

Ab a Ag difundují proti sobě• Stanovení homogenity systému antigen-protilátka• Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění• Používáno následně po purifikaci směsi antigenů• Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny• V agaru bez obsahu antigenu nebo protilátky• Závislost na poměru koncentrací antigenu a protilátky

Dvojitá difúze

Dvojitá difúze

Dvojitá difúze

Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difúze detekce presence nebo absence proteinu v seru

Aglutinační reakce

• Přímá aglutinace• Pasivní aglutinace• Aglutinační inhibice

Ab + Ag nerozpustný (korpuskulární) Aglutinace (shlukování)

Aglutinace - použití• Identifikace mikroorganismů• Identifikace živočišných buněk• Identifikace erytrocytů• Aglutinace přímá - s protilátkou reagují aglutinogeny

na povrchu částic • Nepřímá - reagují rozpustné antigeny nebo haptény,

které se předtím pasivně adsorbovaly na povrch buňky nebo inertní částice

• Aglutinační reakce jsou citlivější než precipitační.

Přímá aglutinace

• Ag je přirozenou složkou částice • Např. testování pacientova séra na

přítomnost protilátek proti určité bakterii:– Pacientovo sérum je sériově ředěno do

zkumavek, mikrotitračních destiček s konstantním množstvím korpuskulárního antigenu. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru

Přímá aglutinace• Stanovení protilátek proti erytrocytům• Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být

ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky)• Řešení: Coombsův test - použití anti

imunoglobulinového séra

Eg. Detection of anti-Rh antibodies in the blood of an Rh- woman

Coombsův Test• Přímý: přidá se protilátka proti lidskému

imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami

• Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Promytí. Přidá se Coombsovo činidlo.

• stanovení Rh protilátek• diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz

volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)

Přímý a nepřímý Coombsův test

Měření vázané protilátky

Měření sérové protilátky

Pasivní aglutinace• Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem

vázaným na nesolubilní částici (latexová částice)• Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti precipitační

reakce• Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních

onemocnění– Diagnostika autoimunitní thyroiditidy:

Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta

- Diagnostika revmatoidní artritidy

Inhibice aglutinace• velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých

množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje.

• Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab.

• Průkaz užívání drog (kokain, heroin). • Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice

hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).

Hemaglutinace

EIA x ELISA• EIA – enzymoimunoanalýza • Heterogenní – vyžadují separaci volné a vázané frakce

analytu • Homogenní – nevyžadují separaci• imunochemická reakce s enzymatickou detekcí ke

stanovení koncentrace antigenu nebo protilátky v neznámém vzorku

• ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (speciální druh EIA) aktuálně heterogenní kompetitivní EIA se značenou protilátkou

• Enzymy – křenová peroxidása a alkalická fosfatása

Principle of ELISA/RIAEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

1 2

3 4

1. Potažení jamek antigenem

2. Přidání vzorku séra

3. Přídání enzymem značené protilátky(anti-human IgG)

4. Přidání substrátu

5. Odečtení barevné reakce

Použití ELISA testů

• Stanovení cytokinů• Stanovení autoprotilátek u

systémových onemocnění (ANCA, anti-ds DNA)

• Speciální modifikace – CAP – specif. IgE (úprava hmoty pro navázání antigenu a použití fluorescenční detekce)

Western blot jako podskupina imunoblotingu

• detekce proteinů po elektroforéze v PAA gelu• princip spočívá v elektrotransferu proteinů z gelu na membránu

a následné detekci pomocí série protilátek• Gel se vloží na membránu (vytvoří se sendvič) a pomocí

elektrického proudu se proteiny z gelu přenesou na membránu, která je na sebe naváže.

• Membrána se potom podrobí inkubaci se sérií dvou protilátek, z nichž první/primární se váže s vysokou specifitou na daný protein. Druhá/sekundární protilátka bývá značena – alkalickou fosfatasou, peroxidasou

• Western blot – slovní hříčka, Southern blot – přenesení DNA z gelu na membránu, posléze Northern blot – pro RNA

Western blottingWestern blot

Využití Western blot

• Autoprotilátky – antigangliosidové u neurologických autoimunitních onemocnění, autoprotilátky u hepatopatií

Imunofluorescence

Přímá – vazba značené protilátkyNepřímá • vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky• k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem. (normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských protilátek.

Průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie: stanovení CD4 T buněk

Monitoring CD4 T buněk u HIV pacienta