Úvod do molekulární biologie -...

transcript

Úvod do molekulární biologie

Struktura a vlastnosti nukleových kyselin

Uchování a přenos genetické informace - replikace

Transkripce

Proteosynthesa a skládání proteinů - translace

Regulace transkripce

Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní

technologie

Metodické přístupy molekulární biologie

Struktura a vlastnosti nukleových

kyselin Deoxyribonukleová kyselina (DNA)

Ribonukleová kyselina (RNA)

Každá monomerní jednotka obsahuje:

1) Fosfátovou skupinu

2) Pětiuhlíkatý monosacharid

• Ribosa

• 2-deoxyribosa

3) Base

Purinové a pyrimidinové

stejné

Nukleové báze

Vlastnosti nukleových bází – souvisí s jejich funkcí

• Planární

• Keto-enol tautomerie

• Slabě bazické

• Spektrální - UV

Monomerní jednotka RNA

Monomerní jednotka DNA

H2C5´ O

C4´ H H C1´

C3´ C2´

Glykosidická vazba Mezi C1 monosacharidu a N

NUKLEOSID

Monosacharid + base

NUKLEOTID

C5´- fosforylovaný derivát

nukleosidu, monomerní

jednotka NK

Uhlíkové atomy v cukerné části

číslovány s čárkou

Strukturní jednotky NK

Glykosidická vazba v

nukleosidech a nukleotidech je u

purinových bází tvořena mezi N9

a C1´ (deoxy)ribosy

Glykosidická vazba v

nukleosidech a nukleotidech je

u pyrimidinových bází tvořena

mezi N1 a C1´ (deoxy)ribosy

Názvosloví

Nukleosidy:

Purinové: přípona – osin (adenosin, guanosin)

Pyrimidinové: přípona – idin (thymidin, cytidin, uridin)

Deoxy-

Nukleotidy:

Nukleosid (x‘) mono-, di-, tri- fosfát

Adenosin 5‘ trifosfát´= ATP, obecně NTP nebo dNTP

Báze se označují jednopísmennými symboly: A T C G U

Funkce nukleotidů • stavební složky nukleových kyselin

• přenašeče energie (ATP, GTP, ligasy, hydrolasy)

• fosforylační činidla (ATP - kinasy)

• aktivátory meziproduktů biosyntéz:

UDPglukosa CDPcholin

Funkce nukleotidů …. • součásti kofaktorů (NAD(P), FAD, AdoMet, CoA)

• regulační molekuly a neuromodulátory (cAMP, cGMP)

• Využití v terapii – antivirotika (AIDS, herpes, hepatitida)

Cyklický AdenosinMonoFosfát

Struktura DNA

• Primární - pořadí nukleotidů 5´ → 3´

• Sekundární

• Terciární

Primární struktura

Zapisujeme:

TACG.....

(dTdAdCdG.....)

Sekundární struktura DNA

dvojitá šroubovice

1953 - James Watson, Francis Crick

Rosalind Franklin -

rentgenostrukturní analysa → meziatomární vzdálenosti,

helikální struktura

Zastoupení basí v DNA (molární %)

Organismus A T G C

Člověk 30.9 29.4 19.9 19.8

Kuře 28.8 29.2 20.5 21.5

Kobylka luční 29.3 29.3 20.5 20.7

Pšenice 27.3 27.1 22.7 22.8

Kvasinky 31.3 32.9 18.7 17.1

E. coli 24.7 23.6 26.0 25.7

Chargaffova pravidla:

[A] = [T] a [G] = [C]

[A] /[T] = [G] / [C] = 1

Princip párování basí

James D.Watson & Francis Crick

Nobelova cena 1962

1. Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix,

vzájemně svinuté, parametry

2. Monosacharid + fosfát´= páteř vně šroubovice – polární

povrch

3. Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů

kolmo na osu, stohování basí, patrové hydrofobní

interakce

4. Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým

pravidlům, vodíkové můstky

5. Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a

malý (úzký a hluboký)

6. Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání:

5‘ → 3‘

3‘ → 5‘

velikost se udává počtem párů bazí – bp

Sekundární struktura

Terciární struktura DNA

Prokaryotní

1 molekula kruhové DNA - 1 chromosom (E.coli 2,6x106 kDa, 1400 m!!)

Plasmid(ová DNA) - autonomně se replikující (zdvojující) mimochromosomální

cirkulární DNA, odlišná od bakteriálního genomu (chromosomální DNA), která

není nezbytná pro kontinuální existenci organismu za neselektivních podmínek.

Eukaryotní DNA je lineární

Chromosomy

+ mimojaderná: mitochondriální, plastidová (pozor!! kruhová)

Kódující úseky – exony, nekódující úseky - introny

Kondenzace, poměr sbalení až 8 000

Základní jednotka - nukleosom

Vlastnosti DNA

DNA poměrně málo stabilní - lze poškodit i mechanicky

Přechod dvouvláknové struktury na jednovláknovou - porušení

hydrofobních interakcí a vodíkových můstků:

Pokles optické otáčivosti

Pokles viskozity

změna spektrálních vlastností

Změna pH - protonace N1 v adeninu a N3 v cytosinu

Pokles iontové síly - odhalení záporných nábojů fosfátové kostry

Teplotní denaturace DNA

Tm = teplota tání DNA

Denaturace může být vratná

- annealing

Tm se ↑ s ↑ zastoupením

GC párů

Hyperchromní efekt:

Ribosa x deoxyribosa

Jednovláknová!

Messenger RNA – mRNA (5%)

Ribosomální RNA – rRNA (80%)

Transferová RNA – tRNA (10 – 15%)

Ribosomální RNA, sekundární struktury: smyčky,

výdutě, helikální úseky

Transferová RNA

3’ konec

Transkripce

Proteosynthesa a skládání proteinů

technologie

Metodický přístup molekulární biologie

Přenos genetické informace

Centrální dogma molekulární biologie:

Základní pojmy:

Templát - vázán nekovalentně - matrice, vzor

Replikace, transkripce, translace – řízené polymerace:

Iniciace, elongace, terminace, postsyntetické úpravy (processing)

Primer - vázán kovalentně - iniciátor růstu řetězců

Replikace DNA

Konzervativní x Semikonzervativní ? Meselson - Stahlův experiment

Meselsonův a Stahlův

experiment nově

vznikající DNA je

kombinací starého a

nového řetězce:

hybridizace

E.coli v mediu s 15 N

Specifické párování bází umožňuje kopírování

ssDNA slouží jako templát

Vysoká rychlost – genom E.coli 4,8 x 106 bp zkopírován za 40 min!!!

tj. inkorporace 2000 bází/s

lidský genom 6 x 1012 bp - replikace zahájena na více

místech najednou

Replikace

Rozvolnění dvojšroubovicové struktury

v počátku replikace

Vznik replikační bubliny – replikační vidlička

Polarita DNA-řetězců v replikační vidličce

DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa

Podmínky:

templát

Sumárně: dNTP + (DNA)n (DNA)n+1 + PPi

Specifita:

Vazba 3‘→ 5‘

Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘

Na začátku nutná přítomnost volné

3‘OH - primer

Mechanismus replikace

Asymetričnost replikační vidličky

Dokončení synthesy zpožďujícího se vlákna

DNA polymerasa I

DNA polymerasa III

DNA ligasa

DNA ligasa – propojení Okazakiho fragmnetů

ATP AMP + PPi

Replikace DNA .....

Terminace

Prokaryota – kruhová DNA

Eukaryota – telomery, telomerasy

Vysoká přesnost kopírování je nezbytná!!!

Pravděpodobnost inkorporace chybné base je 1 : 104

Ve skutečnosti pouze 1 : 1010 Opravný mechanismus??

Nukleasová aktivita DNA polymerasy

Stručná historie sekvenování DNA

• První DNA sekvence

– ~1965 - alanin tRNA (77 basí) z kvasinky

• Vývoj metod pro sekvenování DNA

– 1977 - Maxam-Gilbert a Sanger

Podmínky:

templát

Primer s 3‘OH

Specifita:

Vazba 3‘→ 5‘

Podmínky:

templát

Specifita:

Vazba 3‘→ 5‘

Na začátku nutná přítomnost volné

3‘OH - primer

Sangerova metoda

Založena na použití dideoxynukleotidů

Pro sekvenování je třeba:

• Dostatečný počet kopií DNA

• Vhodný primer

• DNA polymerasa

• „normalní nukleotidy“ v dostatečném množství

• Malé množství dideoxynukleotidů nějak označených (radioaktivně, fluorescenční značkou)

4 reakční směsi:

Elektroforetické

dělení fragmentů

podle Mh

Templát 3’ …CCAAGGGT ………………5’

5’……primer G

GGTTCC

GGTTCCC

GGTTCCCA

Sangerova metoda

Automatické sekvenování

s využitím fluorescenčně

značených

dideoxynukleotidů

Copyright Bios Publishers Ltd

Realita…..

Amplifikace DNA

Metoda PCR - polymerase chain reaction

Polymerasová řetězová reakce

Amplifikace DNA - PCR (polymerase chain reaction)

Reakční směs:

- Taq polymerasa

- Primery: levý

pravý

- Nukleotidy dNTP

• Materiál pro sekvenování

– Sekvenace genomů (HUGO)

– Diagnostika infekčních onemocnění

– Identifikace poruch na úrovni DNA

– Identifikace osob

– Studium evoluce (zpracování fosilií)

• Základ genových technologií - GMO

Využití PCR:

Transkripce

Proteosynthesa

technologie

Metodické přístupy molekulární biologie

Exprese genu

DNA RNA Transkripce

RNA protein Translace

Transkripce

DNA RNA

RNA polymerasa katalyzuje většinu kroků v procesu:

- rozpoznává iniciační místa – promotory

- vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny)

- katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb

- rozpoznává terminační místo

- nemá nukleasovou aktivitu – neopravuje chyby!

Mechanismus syntézy je stejný pro všechny typy RNA

Transkripce

• σ podjednotka:

1. snižuje afinitu RNA polymerasy k nepřepisovaným

oblastem

2. Rozpoznává oblast promotoru

Iniciace - promotor

rozpoznán sigma (σ) podjednotkou RNA polymerasy

prokaryota:

DNA je transkribována enzymem

RNA-polymerázou ( DNA dependentní)

RNAn + NTP → RNAn + 1 + PPi

5´→ 3´

3´→ 5´

- vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny)

- katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb

- rozpoznává terminační místo

Transkripce dvou genů

na snímku z elektronového mikroskopu

Transkripce mnoha RNA najednou

Není třeba opravovat – RNA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu

Posttranskripční úpravy RNA

• 5' čepička (cap)

• 3 ' konec - poly A ocas (tail)

Prokaryota - bez úprav

Eukaryota -

replikace a transkripce jsou časoprostorově oddělené procesy

Sestřih (splicing)

Sestřih RNA

Intergenic Intergenic Gen

Exon Intron Exon Exon Intron

Transkripce pre-mRNA

GT AG AG GT

Exon Exon Exon

Sestřih mRNA

Genom:

Transkriptom:

Translace - proteosynthesa

Probíhá na ribosomech

Mechanismus u všech organismů prakticky stejný

Směr N-konec C-konec

Překlad z jazyka basí do jazyka aminokyselin:

Genetický kód – úkol:

Ze 4 písmen je třeba vytvořit 20 slov :

42 = 16 43 = 64

Dešifrován pomocí syntetických polynukleotidů: poly U → polyphe

Vlastnosti genetického kódu

• Tripletový

• Nepřekrývá se –

• Degenerovaný, pouze trp a met jeden kodon, ostatní více (synonyma)

• Většina synonym se liší basí na třetí pozici

• Degenerace minimalizuje vliv mutací → záměna basí neznamená vždy záměnu AK (Ile, Leu)

• Počet kodonů koreluje s četností výskytu AK v proteinech

• Pouze tři nemají smysl - stop!

• Iniciace – start kodon Met

• Téměř univerzální, výjimky u protozoí a mitochondrií (vlastní sada tRNA)

Proteosynthesa

probíhá na

ribosomech:

rRNA - 80%

buněčných RNA

Ribozymy

25% sušiny E.coli

S = Svedbergův koeficient –

míra rychlosti sedimentace

při centrifugaci

Base → aminokyselina

Vazba AK na tRNA - aminoacyl tRNA synthetasa (ligasa)

sumárně:

AK + tRNA + ATP aminoacyl tRNA + AMP + PPi

Opravný mechanismus – hydrolasová aktivita některých aminoacyl tRNA synthetas

(thr x val)

Iniciace

Elongace – růst peptidového řetězce

Energetická bilance – aktivace AK ekv. 2 ATP

elongace 2 GTP

Terminace – stop kodon, Rf faktor

Proteosynthesa -shrnutí

Exprese genu u prokaryot a eukaryot - shrnutí

• N-glykosidická vazba - Asn

• O-glykosidická vazba - Ser a Thr

fosforylace

Postranslační modifikace proteinů

glykosylace

myristoylace

Posttranslační úpravy proteinů - štěpení

Doprava na místo určení

(targeting)

– signální sekvence pre-

Vznik biologicky aktivní formy z

pro – formy

Příklad - insulin

Regulace genové exprese

• Transkripce a postranskripční procesy

• Degradace RNA

• Translace

• Degradace proteinů

Regulace převážně na úrovni iniciace translace

Konstitutivní geny - kontinuální transkripce – síla promotoru

Indukovatelné a reprimovatelné geny

Příklad: lac operon

Regulace genové exprese

+ regulátor

Operonová teorie:

lac operon

E.coli

Kultivace v mediu

Při nedostatku glc

náhrada laktosou

nejoptimističtější scénář:

Zvýšení nutriční hodnoty potravin

Boj s chorobami

Výživa třetího světa

Snížení spotřeby pesticidů

nejpesimističtější scénář:

Zvýšení úmrtnosti díky alergickým

reakcím

Nevratné zamoření životního

prostředí

Genové technologie (inženýrství)

Manipulace s genomem a s tím související technologie

• Sekvenování celých genomů - tvorba DNA knihoven

• Transkriptomika - Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp.

pathologické situaci

• Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin)

• Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace)

• Klonování organismů -

produkce geneticky identických populací organismů, ale také tvorba kopií DNA

• Genetická modifikace organismů -

vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů

Oblasti využití:

Amplifikace DNA pomocí plasmidů

Technologie rekombinantní DNA

Základ genových manipulací:

Plasmid – vektor

Restrikční endonukleasy

Příprava plasmidu (vektor) – rekombinantní DNA

1. Vhodný plasmid (resistence k

amp a tet

2. Štěpení restrikčními

endonukleasami

3. ligace insertu

4. Transfekce buněk

5. Selekce buněk nesoucích

plasmid s insertem

Selekce plasmidů nesoucích vloženou DNA

DNA knihovny, YAC, BAC

1) Reversní transkriptasa: RNA Dependentní DNA Polymerasa

2) Každý gen je nejméně jednou zastoupen v DNA knihovně

Chromosom

fragmenty DNA

Reversní

Transkriptasa

• Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven

• Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci

• Klonování organismů

Oblasti využití:

Instead of putting the foreign

into a bacterium, put it into a

farm animal that can be milked

so that the factor will be in he

milk. Genetically modified organisms

• Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven

• Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci

• Klonování organismů

Oblasti využití:

Konvenční křížení versus genové technologie

škůdce

Pomalý přirozený

výběr resistentních

rostlin

škůdce

Isolace genu resistence

škůdce

Vložit do jiné rostliny

rychle

nepřirozeně – vedlejší účinky?

Může trvat mnoho generací

Genetické úpravy rostlin

Buňka nesoucí

příslušný gen

Dělení buněk Transgenní rostlina

A single

transformace

Rostlinná

buňka

Buněčná kultura

Rekonstrukce

rostliny

Studium funkce genů

SIGnAL- SALK Institute Genomic Analysis Laboratory

T-DNA SALK lines

resource for systematic genome-wide functional screens, a "phenome-

ready" genome, Up today 24773 lines, representing 15719 individual

genes are available

Agrobacterium tumefaciens

Příprava cDNA

Transkriptom

DNA mikročipy - analýza exprese

• Microarrays detect gene interactions: 4 colors: – Green: high control

– Red: High sample

– Yellow: Equal

– Black: None

• Problem is to quantify image signals

Proteomika

A toto je realita……

Proteom:

Vnější prostředí

Studium procesů probíhajících v živých organismech

Transkripce

Translace

Proteiny

Vnější projevy

Biochemické procesy

DNA Genom

Transkriptom

Metabolom, Fyziom

Proteom

Příprava cDNA

Reversní genetika – studium funkce genů

Úvod do molekulární biologie -...

Documents