Proteomická analýza

Historické mezníky

Tiselius – elfo jako metodikalení protein1933

Sumner – krystalizace ureázy vistém stavu – katalytický

inek1926

Objevena v tšina aminokyselin1819-1904

Název protein - Berzelius1838

Monod a spol. – alosterickézm ny v konformaci protein1963

Sanger – aminokyselinovésložení insulinu1955

Pauling a Corey – sekundárnístruktury protein1951

Martin a Synge – vývojchromatografických technik1942

PROTEINJ. J. Berzelius 1838

Proteios

PROTEOMIKAMarc Wilkins 1994

PROTEOMKompletní sada bílkovin p ítomných v daném okamžiku v bu ce,

nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemnéinterakce, lokalizaci a metabolický obrat.

PROTEOMIKA• kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin

organely, bun né linie, tkán nebo organismu• kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomu za r zných

podmínek

GenyGeny mRNAmRNA ProteinyProteiny

Bu kaBu ka

Vnit ní parametryVnit ní parametry Vn jší parametryVn jší parametry

StárnutíStárnutíGenetickéGenetickédispozicedispozice Onemocn níOnemocn ní Lé ivaLé iva

ŽŽivotníivotníprost edíprost edí

Genová analýzaGenová analýza•• SNPSNP••MutaceMutace••SekvenaceSekvenace

Analýza expreseAnalýza exprese••mRNAmRNA••ProteinProtein

Analýza interakcíAnalýza interakcí•• ProteinProtein--proteinprotein••AntigenAntigen--protilátkaprotilátka••EnzymEnzym--substrátsubstrát••ProteinProtein--DNADNA••LigandLigand--receptorreceptor

Co je to proteomika?decký obor studující proteiny

Proteom Genom

Souhrn všech protein v daném organismu

Lidské t lo obsahuje miliony protein

Exprese protein v rámci jednoho organismuse liší v r zných ástech t la, v r zných

stádiích životního cyklu a v r znýchpodmínkách prost edí

Souhrn všech gen v daném organismu

Lidský genom obsahuje 20-25.000 gen

Genom je konstantní celek

Exprese

+posttransla ní modifikace

+alternativní sest ih

+alternativní zavinutí

Proteomika Genomika

PROTEin+genOME

Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiemkompletní bílkovinné sít bu ky, spíše než studiem

jednotlivých protein .

Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zárovepochopit jejich funkci a strukturu a vytvo it 3D mapu bu ky

(ur it lokalizaci jednotlivých bílkovin).

Cíle proteomiky

íklady obecných funkcí protein

• Enzym• Strukturní protein• Transportní protein• Pohybový protein• Zásobní protein• Signální protein• Receptorový protein• Regula ní protein v genové expresi• Proteiny se zvláštním posláním

• nelze ur it funkci proteinu na základ sekvence DNA nebo mRNA

• nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu

• 200 typ posttransla ních modifikací

• existuje alternativní translace

• !!!! špatná korelace hladin mRNA a skute ných hladin bílkovin !!!

PRO PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU ?

PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁ EJÍ FENOTYP !

Pro proteomika když máme genomiku?

Jeden gen, mnoho bílkovin

Centrální dogma molekulární biologie

Základním stavebním kamenem bílkoviny jeaminokyselina

Od RNA k proteinu

• Jazyk RNA se p ekládá do jazyka protein .Genetický kód nazýváme tripletový, protože t inukleotidy v RNA specifikují jednu aminokyselinuv proteinu

• RNA se sestává ze ty „písmen“: A,U,G,C

Tripletovýkód

• Genetický kód jetripletový

• AUG je startovníkodón, kódujemetionin

• UAA, UAG, UGA jsoustop kódony

• Genetický kód jedegenerovaný: ve

tšin p ípad je jednaaminokyselina kódovánavíc než jedním tripletem(max. 6)

Genetický kód byl rozlušt n na po átku šedesátých let XX. století

Rozlušt ní genetického kódu

• 1961: Marshall Nirenberg vytvo il um lou mRNA,která se sestával ze samých uracil :UUUUUUUUUUUUUUUU atd.

• výsledkem translace byla bílkovina, sestávající zesamých fenylalanin : phe-phe-phe-phe atd.

• Nirenberg uzav el: kodón UUU kódujefenylalanin

• do 1965 byl znám celý genetický kód

Genetický kód se musel vyvinoutvelmi dávno

• Genetický kód je (tém ) univerzální, sdílí jejcelá živá p íroda, od nejjednodušších bakterií posavce

• p íjemným d sledkem je, že díky technikámgenových manipulací jž dnes baktérie vyrábílátky d ležité pro lov ka (nap . insulin, STH)

Rostlinka tabáku, dokteré byl vložen genpro luciferázu odsv tlušek.

Genetický kód se musel vyvinoutvelmi dávno

Do t chto prasat byl vložen gen z medúzy a prasata ve tm sv télkují

Mitochondriální kód se v p titrojicích liší

tecí rámec• kódony mezi sebou nemají mezery, ale p esto jsou teny

jako t ípísmenková „slova“. tecí rámec specifikuje prvnípísmeno, od kterého za ínáme íst a dává nám smysl

ty:• d d jed med

dj edm ed• anglická verse:

– The red dog ate the cat– her edd oga tet hec at– nebo Why did the red bat eat the fat rat?– W hyd idt her edb ate att hef atr at

Translace v eukaryotické bu ce

• Strukturní gen jeepsán do pre-mRNA

• Pre-mRNA jeupravena do mRNA

• mRNA opouští jádro• Na ribozómech

podléhá mRNAtranslaci a vznikápolypeptidový et zec

V prokaryotickébu ce je

transkripcespojena stranslací

Iniciace translace

Elongace polypeptidového et zceElongace za íná p len ním aminoacyl-tRNAke správnému kodonu na A míst ribozomu

Elongace translace

Terminace translaceNa stop kodon se navazuje bílkovina zvaná „release factor“

a syntéza polypeptidu je ukon ena. Nov vzniklý polypeptidse uvolní od tRNA; tRNA se uvolní z ribozómu a dv

ribozomální podjednotky se uvolní od mRNA

Syntéza polypeptidu pokra uje dokud není dosaženo stopkodonu

Terminace translace

Polysomy

• Danou mRNA m že vdaném ase íst víceribozóm

• Tímto zp sobem jemožné vytvo itsou asn mnohopolypeptid z jedinémRNA

Iniciace Elongace Terminace

Polyribozómy

Signální peptidy ur ují právSignální peptidy ur ují právvzniklým protein m jejichvzniklým protein m jejich

bun nou destinacibun nou destinaci

Signální peptid• signální peptid je tvo en sekvencí cca 20

aminokyselin na nebo poblíž N-konci vznikajícíhopeptidu

• signální peptid je rozeznán tzv. SRP ásticí(signal-recognition particle). Tato ástice poutápeptid a ribosom k receptorovému proteinu vmembrán ER.

• receptorový protein v sob obsahuje pór, kterýmpeptid pronikne do ER. Enzymy potom signálnípeptid obyvkle odstraní

• Ubikvitinylace

Transkripce atranslace v

eukaryotické bu ceehled

Srpkovitá anémieSrpkovitá anémie

Nár st diverzity proteinPosttransla ní modifikace

Alternativní sest ihAlternativní zavinutí

Primární transkriptmRNA p ed posttranskrip ní

modifikací

Posttransla nímodifikaceAlternativní zavinutí

Alternativní sest ih

Posttransla ní modifikace

Chemická modifikace protein potranslaci

1. P ipojení funk ních skupin (acetát, fosfát,lipidy, cukry)

2. Modifikace amino skupin

3. Strukturní zm ny (tvorba disulfidickýchvazeb, proteolytické št pení)

Z primárního transkriptu (1 genu) vzniká více mRNA a tedy více r zných protein

Alternativní sest ih

Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energieExistuje však n kolik alternativních konformací.

Globální minimum(nativní stav)

Lokální minima(alternativní konformace)

Alternativní zavinutí

Schéma sou asné proteomiky

Základní schéma analýzy užívané vproteomice

Sm sprotein

Jednotlivéproteiny

Peptidy

Hmotnostníspektra peptid

Identifikaceprotein

1. Separace2D-PAGE

2. IzolaceŠt pení trypsinem

3. Hmotnostní analýzaHmotnostní spekroskopie

5. Porovnání sdatabází

4. Sekven ní analýzaFragmentace peptid

Sekvence peptid

Aplikace proteomiky v medicín(proteomika nemocí)

Vývoj nových lék

Biomarkery nemocí

Exprese protein u nemocíÚloha protein vevzniku nemocí

Detekce protein vznikajících b hemnemoci je využita k diagnóze

Alzheimerova choroba (amyloid )Srde ní onemocn ní (interleukin-6 a 8, sérový

amyloid A, fibrinogen, troponiny)Renální bun ní karcinom

(karbonanhydrasa IX)

Informace o proteinech zp sobující onemocn ní jevyužita pro vývoj nových lék

1. Známá 3D struktura proteinu-po íta ová simulace-hledáníléku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa)

2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývojindividuálních lék

Úloha protein ve vzniku nemocí

Alzheimerova choroba (AD)Neurodegenerativní onemocn ní charakterizované ztrátou

neuron a synapsíNeuropatologické znaky jsou amyloid ß v senilních placích a neufibrilární

vlákna intracelulárn

Oxida ní stres

Nerovnováha mezi tvorbou volných radikál a antioxida ním systémem

sledky:

Oxidace protein , lipid , DNA a cukr

Oxidace protein

Št pení peptidovéhoet zce

(Karbonyly protein )

Oxidace Ak zbytk

(Nitrotyrosin)

Navázání produktperoxidace lipid i

glykoxidace

Schéma pokusu

Výsledek

Potvrzení úlohy oxida ního stresu u Alzheimerovy chorobyPosttransla ní modifikace protein v mozku navozená oxida ním poškozením

ispívá k rozvoji ADIdentifikace poškozených protein , které jsou potenciální cíle pro lé bu

Úloha protein ve vzniku nemocí

Biomarkery nemocí

Plasmatické biomarkery u AD

Diagnóza AD

Klinické projevy+post mortem (histologie)

Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina-CSF sešpatn získává)

Periferní krev

Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den

Plasma by mohla být zdroj biomarker

Identifikace diagnostických biomarker v periferní krvi

za pomocí proteomiky:

Vzorky krve pacient s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí

2D gelové elektroforézy

Byly identifikovány body, které se lišily u pacient a kontrol

Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

Výsledek15 bod signifikantn odlišných u nemocných a kontrol

Analýza pomocí MS: nap . α2 makroglobulin, komplement faktor H

Vývoj nových lék

Informace o proteomu vedou k identifikaci protein zp sobující onemocn ní

1. Po íta ový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových lék

Nap . protein zp sobující onemocn ní-3D struktura-po íta vyvine látku, kteráho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym)

2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-po íta vyvine individuální lék,

který je efektivn jší

Virtual ligandscreening

HIV 1-proteasa

Št pí HIV protein na menší funk ní proteiny;virus nep ežije bez tohoto enzymu

(nejvýznamn jší cíl lé by HIV)

Proteomika studuje proteiny, hlavn jejich strukturu, funkcia interakce

Genom byl již zmapován, nyní je na ad proteom (milionyprotein )

Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezizákladní pat í 2D gelová elektroforéza a hmotnostní

spektroskopie

Proteiny ur ují fungování organismu a jejich patologiespouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro

zjiš ování p in chorob, diagnózu a lé bu

Souhrn

Proteinové databáze

• www.expasy.ch