portal.szspraha1.czportal.szspraha1.cz/szs/portal.nsf/0/438D7E7832EFCAE3C... · Web viewZáklady...

Imunohistochemie v praxi

Absolventská práce

Tereza Bartáková

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická školaPraha 1, Alšovo nábřeží 6

Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborantVedoucí práce: RNDr. Alena Lodererová

Datum odevzdání práce: 30. 8. 2011Datum obhajoby: 12.9. 2011

Praha 2011

1

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací.

Praha 29. srpna 2011 …………………………..

Podpis autora (ky)

2

Poděkování

Děkuji RNDr. Aleně Lodererové za odborné vedení absolventské práce. Děkuji také MUDr. Evě Honsové, PhD. za poskytnuté obrázky a informace.

3

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1,Alšovo nábřeží 6.

……………………………

Podpis autora(ky)

4

ABSTRAKT

Tereza Bartáková

Imunohistochemie v praxi

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola,Praha1,Alšovo nábřeží 6

Vedoucí práce: RNDr. A. Lodererová

Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2011, 46 stran

Imunohistochemickými reakcemi se lokalizují antigeny v tkáňových řezech s použitím

protilátek jako specifickými látkami. Je založena na interakcích mezi antigeny a

protilátkami. Protilátky používané pro specifickou detekci, mohou být polyklonální

nebo monoklonální. S rozšířením a vývojem imunohistochemických technik byly

zavedeny enzymy, jako například peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Existuje mnoho

imunohistochemických metod, které mohou být použity k lokalizaci antigenů. Výběr

vhodné metody by měl být založen na typu vyšetřovaného vzorku a stupni požadované

citlivosti. Fixace tkáně je základem imunohistochemie. Pro zachování buněčné

morfologie je základní rychlá a adekvátní fixace. Neexistuje jedno univerzální

fixativum, které by bylo ideální pro průkaz všech antigenů. Mnoho antigenů může být

úspěšně prokázáno ve formolem fixovaných parafínem zalitých řezech. Průkaz mnoha

antigenů může být podstatně zlepšen předošetřením v revitalizačním pufru. Tyto

techniky zahrnují aplikaci tepla nebo enzymů. Pozadí barvení může být specifické nebo

nespecifické a mělo by být blokováno před použitím primární protilátky. Přímá metoda-

jednostupňová metoda, kdy je protilátka reagující s antigenem v tkáni přímo značená.

Nepřímá metoda- protilátka reagující a antigenem v tkáni není značená (první vrstva),

značená sekundární protilátka (druhá vrstva) reaguje s primární protilátkou. ABC

metoda je standartní imunohistochemická metoda a jedna z nejvíce užívaných technik

v imunohistochemii. Tato technika je trojstupňová. LSAB je technicky podobná

metodika ABC metodě. Polymerová metoda je unikátní chemická metoda, která

dovoluje vazbu velkého množství molekul enzymů na sekundární protilátku přes

polymerovou kostru. Imunohistochemie se stala rozhodující technikou, široce

používanou v mnoha medicínských výzkumných laboratořích, stejně tak jako v klinické

diagnostice.

Klíčová slova: Imunohistochemie, protilátky, fixace, metody, dvojité barvení.

5

ABSTRAKT

Tereza Bartáková

Imunohistohemie v praxi

Immunohistochemistry in practice

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola,Praha1,Alšovo nábřeží 6

Vedoucí práce: RNDr. A. Lodererová

Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2011, 46 stran

Immunohistochemistry is the localization of antigens in tissue sections by the use of

antibody as specific reagents through antigen-antibody interactions. The antibodies used

for specific detection can be polyclonal or monoclonal. With the expansion and

development of immunohistochemistry technique, enzyme labels have been introduced

such as peroxidase and alkaline phosphatase. There are numerous

immunohistochemistry methods that may be used to localize antigens. The selection of

a suitable method should be based on parameters such as the type of specimen under

investigation and the degree of sensitivity required. Tissue preparation is the

cornerstone of immunohistochemistry. To ensure the preservation of tissue architecture

and cell morphology, prompt and adequate fixation is essential. There is no one

universal fixative that is ideal for the demonstration of all antigens. However, many

antigens can be successfully demonstrated in formalin-fixed paraffin-embedded tissue

sections. The demonstration of many antigens can be significantly improved by the

pretreatment with the antigen retrieval reagent. The techniques involve the application

of heat or enzyme digestion reagent. Background staining may be specific or non-

specific and should be blocked by the pretreatment of the tissue section before using

primary antibody. Direct method is one step staining method, and involves a labeled

antibody reacting directly with the antigen in tissue sections. Indirect method involves

an unlabeled primary antibody (first layer) which reacts with tissue antigen, and a

labeled secondary antibody (second layer) which reacts with primary antipody. ABC

method is standard IHC method and one of widely used technique for

immunhistochemical staining. The technique involves three layers. LSAB is technically

similar to standard ABC method. Polymeric Methods is unique chemistry method which

permits binding of a large number of enzyme molecules to a secondary antibody via the

backbone. Immunohistochemistry has become a crucial technique and widely used in

many medical research laboratories as well as clinical diagnostics.

Keywords: Immunohistochemistry, antibody, fixation, methods, double staining

6

http://en.wikipedia.org/wiki/Monoclonal_antibodies

http://en.wikipedia.org/wiki/Polyclonal_antibodies

Obsah1 Úvod...........................................................................................................................82 Základní typy imunohistochemických reakcí..........................................................12

2.1 Přímá metoda....................................................................................................122.2 Nepřímá dvojstupňová metoda.........................................................................122.3 Nepřímé trojstupňové metody..........................................................................122.4 Polymerové techniky........................................................................................14

3 Obecné schéma imunohistochemického protokolu..................................................153.1 Odběr a fixace tkáně.........................................................................................153.2 Zpracování bioptického materiálu....................................................................183.3 Krájení a napínání histologických řezů............................................................193.4 Optimalizace prezentace antigenů....................................................................203.5 Blok imunních a neimunních vazeb..................................................................213.6 Vazba protilátek a detekčního systému.............................................................223.7 Vizualizace komplexu antigen-protilátka.........................................................223.8 Dobarvení tkáně................................................................................................233.9 Dehydratace a montáž preparátu.......................................................................23

4 Hybridizace in situ...................................................................................................244.1 Přímá metoda....................................................................................................244.2 Nepřímá metoda................................................................................................244.3 Obecná pravidla při hybridizaci in situ.............................................................284.4 Příklad hybridizace in situ- Detekce HPV kitem DAKO.................................28

5 Imunohistochemie v praxi........................................................................................306 Dvojité imunohistochemické barvení (Double staining).........................................38

6.1 Postupné imunoenzymové dvojité barvení.......................................................386.2 Současné imunoenzymové dvojité barvení.......................................................39

7 Závěr:.......................................................................................................................42

7

1 Úvod

Cílem této práce je zvýšit povědomí a informovanost i imunohistochemii jako o

podstatném vědním oboru, který je velmi důležitý nejen v oblasti klinické

diagnostiky, ale také ve výzkumné oblasti.

Histochemie se rozvíjela přibližně od 30. let 20. století na hranici histologie a

analytické chemie a biochemie. Jejím cílem je identifikovat a lokalizovat chemické

látky v místě jejich výskytu v tkáních na úrovni histologické či cytologické.

Imunohistochemické metody slouží k průkazu tkáňových či buněčných

antigenů pomocí vazby mezi antigenem a protilátkou. Je to jedna z modernějších metod,

která vychází z histochemie, zaváděním nově objevovaných zákonitostí specifické

imunologické reakce a s dalším rozvojem její dostupnosti pro laboratoře. Základem byla

možnost vazby molekul imunoglobulinů s jinými molekulami, což se stalo předmětem

výzkumu již ve 30. letech 20. století. Ve 40. letech se zdařil první průkaz antigenů v

tkáni pomocí protilátky značené fluoresceinem -přímou imunofluorescenční metodou.

Do patologické diagnostiky se tyto techniky dostávaly od 50. let a postupně byla

zlepšována specifita, senzitivita a dostupnost stále většího spektra metod, k čemuž

napomohl i vývoj molekulárního, genového a proteinového inženýrství nezbytný pro

produkci reagencií potřebné kvantity a kvality. V 60. letech došlo k prvnímu použití

enzymu (křenová peroxidáza) a substrátu jako techniky pro značení protilátky s cílem

vizualizace. V 70. letech 20. století byly připraveny protilátky proti jednomu epitopu

(antigenní determinantě) - monoklonální protilátky. Ve stejné době se začalo využívat

spojení enzymu s protilátkou, které vyústilo v širší zavedení imunohistochemie do

praxe, a to zejména u tkáňových řezů fixovaných ve formolu a zalitých v parafinu. Tím

vznikla možnost sjednotit odběr tkáně a zpětně vyšetřovat vzorky odebrané již dříve (5).

Antigen je substance schopná vyvolat tvorbu protilátek. Jde o makromolekulární látky

nebo nízkomolekulární látky (hapteny) navázané na vysokomolekulární nosič. Z

chemického hlediska jde nejčastěji o proteiny, polysacharidy nebo nukleové kyseliny.

8

Podle lokalizace antigenů dělíme antigeny na endogenní (např. cytoskeletární a

membránové) a exogenní (bakteriální a virové). Specifické místo antigenu, na které se

váže protilátka, se nazývá epitop neboli antigenní determinanta. Většina antigenů má

více epitopů, které vyvolávají vznik různých protilátek namířených proti jednotlivým

epitopům (2).

Protilátky neboli imunoglobuliny, zkráceně Ig jsou jednou ze základních složek

imunitního systému, sloužící především k rozpoznání cizích molekul. Jsou to

glykoproteiny produkované B-lymfocyty, jejichž celková koncentrace se pohybuje v

krevním séru v rozmezí 15-20 g/l a tvoří tak asi 20% všech proteinů krevního séra.

Imunoglobulinů máme 5 tříd- IgA, IgE, IgD, IgG a IgM ,třídy IgA a IgG mají ještě

podtřídy. Protilátky třídy IgG jsou v séru zastoupeny v největším množství- 75%, jsou

produkovány převážně během sekundární imunitní odpovědi. Mají tvar písmene Y se

dvěma stejnými vazebnými místy pro antigen na konci každého ramene. Molekula IgG

je tvořena dvěma těžkými a dvěma lehkými řetězci, které jsou spojeny disulfidickými

můstky a také kovalentními vazbami. Tato struktura je společná všem Ig. IgM tvoří

přibližně 10% všech Ig séra a objevuje se v krvi v časném stádiu odpovědi na antigen. V

séru se vyskytuje ve formě pentaméru, tvořeného pěti jednotkami, které mají stejnou

strukturu jako IgG. Molekula IgM má 10 vazebných míst pro antigen. Variabilní oblast

protilátky je vazebné místo pro připojení antigenu a je složeno přibližně ze 110

aminokyselin, jejich sekvence (pořadí) je zodpovědná za vznik protilátek s různou

specifitou (1,2).

Obrázek 1- STRUKTURA IMUNOGLOBULINU (16)

9

Monoklonální protilátky- v roce 1975 Kőhler a Milstein vyvinuli techniku, která

umožňuje in vitro růst buněčné populace jednoho klonu produkujícího protilátky žádané

specifity. Jsou produktem jednoho klonu B-lymfocytů, tudíž jsou specifické proti jediné

antigenní determinantě. Zvíře určené pro výrobu protilátky je imunizováno (v počátcích

rozvoje technologie pouze myši, v dnešní době stále častěji králičí monoklonální Ab)

vybraným antigenem. Sloučením normálních B-lymfocytů pocházejících z

imunizovaného živočicha (ze sleziny se připraví buněčná suspenze) a neoplastických

myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné

produkce monoklonálních protilátek. Zatímco mateřský normální B-lymfocyt (od

imunizovaného dárce) je nositelem specifity produkované protilátky, myelomová buňka

je nositelem vysokého až neomezeného proliferačního potenciálu = nesmrtelnosti.

Hybridom tak zdědí po myelomové buňce možnost nepřetržitého růstu a po

aktivovaném B-lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonální protilátku namířenou

proti jedné antigenní determinantě. Monoklonální protilátky produkované

hybridomovou linií jsou identické, jsou jedné třídy, respektive podtřídy a vykazují

vazbu na stejnou antigenní determinantu. Váží se na ni se stejnou afinitou a mají stejné

fyzikálně- chemické vlastnosti. Při přípravě monoklonálních protilátek je často získáno

více hybridomů produkujících protilátky proti různým epitopům jednoho antigenu(2,5).

Polyklonální protilátky se získávají imunizací laboratorních zvířat antigenem (nebo 10

Obrázek 2- PŘÍPRAVA MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY (17)

jejich směsí). Jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B-lymfocytů, a proto jsou

namířeny proti více epitopům určitého antigenu nebo směsi antigenů. Při imunizaci

organizmu dochází ke stimulaci různých B-lymfocytů a k jejich proliferaci a

diferenciaci na plazmatické buňky. Je produkováno spektrum protilátek proti různým

epitopům příslušného antigenu s různou schopností se na ni vázat. Po úspěšné imunizaci

se zvířeti odebere sérum či ascites obsahující protilátky proti původnímu imunogenu.

Specifita polyklonálních protilátek velice závisí na imunizačním protokolu, resp. na

tom, v jaké fázi imunitní odpovědi zvířete jsou z něj protilátky získávány (2,5,8).

Obrázek 3- ZVÍŘATA PRO VÝROBU PROTILÁTEK (18)

Příprava monoklonálních protilátek je časově i technicky velmi náročná, podaří-li se

ale získat hybridom produkující protilátku žádané kvality, získáváme standartní

reagencii v prakticky neomezeném množství. Hybridomy je možné mrazit, dlouhodobě

uchovávat v tekutém dusíku a podle potřeby znovu rozmrazit. Pro přípravu většího

množství monoklonální protilátky není potřeba opakovaná příprava antigenu.

Monoklonální protilátka reprezentuje jednu složku polyklonální odpovědi, rozpozná

pouze jeden epitop antigenu, zatímco polyklonální protilátky většinou rozpoznají více

epitopů téhož antigenu. Monoklonální protilátky jsou nezastupitelné při sledování

jednotlivých izoforem proteinů nebo při mapování funkčních míst proteinů (1,2,5).

11

2 Základní typy imunohistochemických reakcí

2.1 Přímá metoda

Primární protilátka je přímo označená fluoresceinem, enzymem. Přímé metody lze užít,

je-li antigen ve studované tkáni přítomen v dostatečně vysoké koncentraci. Využití

zejména v nativních řezech, při použití v parafínových řezech je metoda málo citlivá

(1,2,5,6).

2.2 Nepřímá dvojstupňová metoda

Provedení je komplikovanější, ale metoda je citlivější. Na tkáňové řezy se aplikuje

neoznačená protilátka specifická proti prokazovanému antigenu (primární protilátka), na

ni se nanáší protilátka proti Fc-fragmentu imunoglobulinů zvířete, který byl dárcem

primární protilátky, která je značená (1,2,5,6).

2.3 Nepřímé trojstupňové metody

Nepřímé trojstupňové metody slouží k zesílení signálu, když je množství antigenu ve

tkáni nízké.

Dva typy nepřímé trojstupňové metody

• metoda PAP nebo APAAP

• metoda ABC

Metoda PAP nebo APAAP- první krok- reakce specifické protilátky s antigenem ve

tkáni. Druhý krok- aplikace neznačené protilátky proti imunoglobulinům zvířete, jehož

protilátky se používají v první a třetí fázi. Sekundární protilátka - spojovací, tvoří

můstek, který se přidává v nadbytku, aby nebyla vazebně vysycena obě ramena IgG

molekuly, což by poskytlo falešně negativní výsledek. Při třetím kroku se nanáší

značený komplex, např. PAP-peroxidáza-anti-peroxidasový komplex nebo značený

komplex s alkalickou fosfatázou APAAP-alkalická fosfatáza-anti-alkalická fosfatáza.12

Metoda ABC je metoda založená na tvorbě pevné ireverzibilní vazby vaječného

glykoproteinu bílku avidinu, s vitaminem H biotinem. Avidin má schopnost vázat 4

molekuly biotinu. Některá vazebná místa avidinu jsou volná a některá jsou obsazena

komplexem biotin-peroxidáza nebo biotin-alkalickou fosfatázou. Volná místa jsou

připravena pro navázání biotinylované protilátkové molekuly. Při použití avidinu

získaného z bakterie Streptomyces avidini, který dává lepší reakci, nazýváme tento

komplex SABC, tj. streptavidin-biotin-komplex (1,2,5,6).

Obrázek 4- METODA ABC (18)

13

Obrázek 5- ZNÁZORNĚNÍ METOD (19)

2.4 Polymerové techniky

V současnosti se imunohistochemie posunula dále, alternativou k SABC technikám jsou

polymerové techniky, příkladem je Histofine Simple Stain, je to značený polymer

připravený spojením aminokyselinového polymeru s alkalickou fosfatázou nebo

peroxidázou a kozími anti-myšími a anti-králičími imunoglobuliny, redukovanými na

Fab fragment. Tento polymer je uchováván v MOPS (3- morfolinpropansulfonová

kyselina) pufru (pH 6,5) obsahujícím stabilizátor a antibakteriální agens. Tato reagencie

je běžně použitelná pro řezy lidských tkání fixované formaldehydem a zalité parafinem

(9).

14

3 Obecné schéma imunohistochemického protokolu (1,4)

• odběr a fixace tkáně

• krájení a napínání histologických řezů

• optimalizace prezentace antigenů

• blok endogenní aktivity enzymů

• blok pozadí

• vazba primární protilátky

• detekční systém

• vizualizace komplexu antigen-protilátka

• dobarvení tkáně (zejména buněčných jader)

• dehydratace a montáž preparátu

3.1 Odběr a fixace tkáně

Způsob odběru (14)

• operační materiál- vše, co odejme chirurg (končetina, žaludek, slezina, prs, střevo),

podle zásad odběru musí být preparát předán patologovi bez dalšího zásahu (bez

rozstřižení, rozříznutí)

• excize- vše, co bylo získáno vynětím z povrchu těla nebo dutin s povrchem

souvisejících (kožní excize, sliznice ústní, excize z děložního čípku…)

• endobiopsie- materiál získaný fibroskopem za zrakové kontroly (zažívací trakt,

dýchací cesty, močový měchýř…)

• kyretáž - dutina děložní, procesy v kostech…

• punkční biopsie- vzorek je získán napíchnutím tlustou jehlou– biopsie jater, ledviny,

plic (proužek tkáně 10-20 mm dlouhý, 2 mm tlustý), často punkce pod ultrazvukovou

nebo CT kontrolou

15

Zásady odběru (14)

• vhodná přepravní nádoba

• materiál obklopen fixativem ze všech stran

• snadná manipulace s materiálem (tkáň po fixaci ztuhne ve výchozím tvaru –

pokud malá nádoba či úzké hrdlo nádoby => nelze vyjmout)

• při odběru nesmí dojít k záměně materiálu – na odběrovém místě připravena

pouze jedna lahvička pro konkrétního pacienta. Materiál ukládat až do lahvičky

označené štítkem

• během transportu na patologii zabránit rozbití obalu (nutná likvidace materiálu,

aby se zabránilo záměně)

• v zimním období rovněž nutná ochrana proti zmrznutí (chladové poškození

buněk a znehodnocení materiálu)

Fixace je důležitá pro zachování struktury buněk a tkání ve stavu, který je co

nejpodobnější tomu, v němž se vyskytují zaživa. Správná fixace odebrané tkáně má

zásadní význam pro správnost imunohistochemické detekce, protože správný průkaz

buněčných proteinů závisí na jejich zachování v tkáňových řezech (1,2,3,5).

Fixace zastaví metabolické děje zpomalením či stabilizací enzymů a dalších proteinů,

zabrání autolýze inaktivací lyzosomálních enzymů a zastaví růst bakterií a plísní. Toho

lze dosáhnout

fixačními roztoky nebo parami (pufrovaný vodný roztok formaldehydu event. s

kyselinou pikrovou a kyselinou octovou jako Bouinova tekutina, roztok

glutaraldehydu, kyseliny octová, trichloroctová, pikrová)

zmrazením tkáně

teplem (při fixaci tkáně pomocí mikrovln nedochází ke ztrátě proteinů ve

srovnání s chemickou fixací) (1,2,5)

Výběr správného fixativa je vázán na konkrétní reakci, kterou se chystáme následně

provádět, a na typ prokazované látky. Proto bývá součástí všech reakčních souprav pro

imunohistochemii též informace o požadovaném typu fixace. V současné době je

dostupné široké spektrum reagencií umožňujících provádět velkou část

imunohistochemických reakcí na běžných řezech, tj. fixovaných pufrovaným neutrálním

roztokem formaldehydu a zalitých do parafinu. Změny antigenů, ke kterým během

16

fixace dochází, mohou i nemusí ovlivnit jejich reaktivitu v imunohistochemické reakci.

Proto je vhodné zvolit jako součást dané imunohistochemické metodiky konkrétní

vyzkoušený či výrobcem doporučený způsob fixace (2).

Nejčastěji používanými fixativy jsou aldehydy, zejména pufrovaný vodný roztok

formaldehydu o koncentraci 4 %. Formol blokuje aminoskupiny, vytváří metylenové

můstky a tím tkáně okyseluje- zvyšuje negativní náboj a zvyšuje jejich bazofilii.

Původně byl pokládán za mírný fixační prostředek, který je možné po fixaci vyprat a

zbytek odstranit během následného odvodnění alkoholem, ale tento předpoklad byl

později vyloučen, pouze drastické metody nebo dlouhotrvající praní jsou částečně

účinné, avšak nevhodné v histologii a v histochemii. Ani aplikace alkoholu při

dehydrataci tkáňových bloků neodstraní zbývající formaldehyd z tkání. Aplikace

proteolytických enzymů, inkubace v mikrovlnné troubě, vodní lázni nebo tlakovém

hrnci jsou nejúčinnější metody vyvázání části funkčních skupin z tkání fixovaných

formaldehydem. Roztok formaldehydu vydrží při pokojové teplotě v tmavé lahvi na

tmavém místě velmi dlouhou dobu. Fixují se tkáňové bloky velikosti 10x10x2,5 mm po

dobu 24 hodin. Větší bloky je možno uložit do formaldehydu pouze na krátkou dobu,

jelikož by to vedlo k přefixování vrchních vrstev materiálu, ale zároveň k autolýze

hlouběji uložených tkání. Podobný účinek jako formaldehyd má glutaraldehyd, který se

používá jako fixativum pro elektronovou mikroskopii, jelikož je to dialdehyd, je jeho

reaktivita a inaktivace skupin daleko vyšší. K dalším činidlům chemické fixace patří

vedle aldehydů i alkoholy- nejužívanější jsou methanol a ethanol (jež odnímají z tkáně

vodu)- fixované bílkovinné molekuly a polypeptidové řetězce se během koagulace

shluknou či stočí do klubka, takže přístupnost některých funkčních skupin se může

pozměnit, ale nedochází přitom k jejich zablokování. Průnik alkoholu do tkání je ale

relativně pomalý, tudíž není použitelný pro rutinní provoz. Malé tkáňové bloky ale

fixuje rychle a mimo to dovoluje rychlé proniknutí protilátek do tkání. Je také vhodný

pro fixaci kryostatových řezů a nátěrů, pro průkaz membránových antigenů. Aceton má

podobné koagulační účinky jako alkohol, a také působí extrakci lipidů z řezů. Nejčastěji

se používá ve směsi s metanolem k fixaci kryostatových řezů z hluboce zmrazených

tkání. Nepříznivé vlivy fixace na tkáň lze částečně ovlivnit dalšími postupy (2).

17

3.2 Zpracování bioptického materiálu

makroskopický popis materiálu

z větších částí tkání zhotovení tkáňových bloků cca 1,5 x 1 x 0,5 cm lékařem

opětovné vložení do fixační tekutiny

zpracování v AUTOTECHNIKONU

Následující postupy jsou prováděny v IKEMU na Pracovišti Klinické a transplantační

patologie na přístrojích Leica TP 1020, Medite TPC 15 a Sakura VIP 5 Jr.

Zpracování malých fragmentů v autotechnikonu tzv. „NA RYCHLO“- délka

cca 58 min

Formol 10% 10 minut

Alkohol 96% 6 minut

Alkohol 96% 6 minut

Izopropylalkohol 5 minut

Izopropylalkohol 5 minut

Xylen 5 minut

Xylen 5 minut

Parafín 5 minut

Parafín 5 minut

Zpracování větších částí tkání v autotechnikonu tzv. DLOUHÝ PROCES- cca

15,5 hod

Formol 1 hodina

Alkohol 96% 1 hodina




Izopropylalkohol 50% 1 hodina

Izopropylalkohol 50% 1 hodina

Xylen 1 hodina

Xylen 1 hodina

18

Xylen 1 hodina

Parafín 60°C 1 hodina 30 minut

Parafín 60°C 2 hodiny

Parafín 60°C 2 hodiny

3.3 Krájení a napínání histologických řezů

Následuje vlastní zalití tkáně. Dříve na našem pracovišti probíhalo pomocí tzv.

„ELEK“. Dvě „elka“ se dala proti sobě na pevnou podložku, do vytvořeného čtverce,

popřípadě obdélníku, podle velikosti tkáně se nalil parafín, vložila se tkáň, na ní

kapslička popsaná číslem, dolila se parafínem a nechala zatuhnout.

V současné době se na našem oddělení používá zalévací automat Microm EC 350-2,

který způsob zalévání zjednodušuje a zkracuje, neboť obsahuje zásobník s již

rozehřátým parafínem, dávkovač parafínu, sadu kovových kapsliček různých velikostí,

vyhřívaný držák na pinzety a chladící zařízení.

Bloky se nechají vychladit na chladící desce a pak se krájí na mikrotomu. Výběr

mikrotomu záleží na požadavcích oddělení, na našem se používá sáňkový mikrotom

Leica SM 2000R se žiletkami. Řezy pro imunohistochemickou diagnostiku krájíme na

tloušťku 4μm (při této tloušťce je u většiny tkání zachycena přibližně jedna vrstva

buněk). Nakrájené řezy přeneseme na vodní lázeň, která je vyhřátá na teplotu kolem

40°C, necháme vypnout a poté přeneseme na připravená podložní sklíčka, která jsou

potažená vhodnou lepivou substancí( vždy jen v tenké vrstvě, silnější by mohla způsobit

zbarvení pozadí), například silan, poly-L-lysin, popřípadě máme připravená koupená,

předem upravená skla například Starfrost od firmy Knittel glass nebo Superfrost Plus od

firmy Thermo Scientific. Sklíčka dáme ještě vypínat na vyhřívací ploténku, jejíž teplota

je okolo 40°C a následně přeneseme do termostatu a to buď do 37°C do druhého dne

nebo do 60°C na 45 minut.

Čím je struktura tkáně díky fixačním postupům lépe zachovaná, tím bývají původní

tkáňové antigeny obtížněji prokazatelné. Nepříznivé vlivy fixace na tkáňové antigenní

struktury lze do jisté míry zmírnit. Tkáňové řezy je proto vhodné před dalšími kroky

zpracování ošetřit, a to tak, aby jejich povrchy lépe nabízely antigeny primární

19

protilátce, tzn., aby antigeny nebyly překryty jinými molekulami bránícími specifické

reakci. Tento krok lze provést na deparafinovaných a rehydratovaných řezech (2,5).

Řezy deparafinujeme v lázních xylenu a alkoholu- 3 lázně xylenu každá 5 minut, 3

lázně 96% alkoholu každá 5 minut a 1 lázeň 70% alkoholu 5 minut. Následně

přeneseme řezy do kyvety a propláchneme destilovanou vodou, ve které řezy

ponecháme do dalšího zpracování.

3.4 Optimalizace prezentace antigenů

1. Proteolytické enzymy

2. Mikrovlnná trouba, tlakový hrnec, autokláv, vodní lázeň

1. Částečná digesce molekul tkáně proteolytickými enzymy může do jisté míry

obnovit antigenní vlastnosti biologického materiálu v parafinovém bločku. Mezi

nejpoužívanější proteázy patří trypsin, pepsin, pronáza a ficin.

Roztoky musí být čerstvě připravené a používají se v koncentraci od 0,05% do

0,3%. Inkubace mají být prováděny při 37°C, protože při nižších teplotách je

jejich aktivita nižší.

2. Nepříznivé účinky na tkáně je také možné do určité míry ovlivnit pomocí

mikrovlnné stimulace. Mikrovlny můžeme využít v jakémkoliv stádiu

zpracování tkáně. Jsou to elektromagnetické vlny s frekvencí mezi 300 MHz a

300 GHz odpovídající vlnové délce 1m až 1mm.Vysoká délka expozice je pro

organismus nebezpečná, protože tkáně velmi dobře absorbují MW energii a

hromadí teplo. Mikrovlnné záření je neionizující. Jeden foton má mnohem

menší energii než množství, které je potřeba na rozbití nejslabší molekulární

vazby. Některé antigeny či jejich epitopy nemohou být v parafínových řezech

detekovány bez použití mikrovln vůbec a pro další je zřejmé výrazné zlepšení

rozdílu mezi signálem a pozadím. Pro dobrý výsledek musí být dodrženy určité

podmínky, které vycházejí z optických vlastností média a jeho tvaru. Pokud je

index lomu media vyšší než 2, nachází se uvnitř objektu ohnisko, v němž

dochází k přehřátí. V případě speciální mikrovlnné trouby stoupá teplota

podstatně rychleji a po dosáhnutí nastavené teploty se teplota udržuje. Domácí

mikrovlnné trouby pracují na frekvenci 2,45 MHz. Mikrovlny pronikají do

roztoků a tkání různými způsoby. Při dobrých vodičích je hloubka proniknutí

20

velmi malá a do špatných vodičů pronikají hluboko. Při nevodičích se mikrovlny

šíří jako ve vakuu (1,5,6).

Skla s řezy vložíme do skleněné Petriho misky, odolné vůči vysokým teplotám s

roztokem, který demaskuje prokazovaný antigen- CITRÁTOVÝ PUFR-pH 6, EDTA-

pH 8, TRIS/EDTA- pH 9. Vložíme do mikrovlnné trouby a zapneme na 2 minuty, po

uplynutí nastavíme další 2 minuty a zároveň natáhneme budík na 15 minut. Když budík

ukazuje 10 minut do konce, nastavíme mikrovlnnou troubu opět na 2 minuty a to samé

provedeme v pěti minutách. Po zazvonění budíku vyndáme Petriho misku z mikrovlnné

trouby, opatrně skla vyjmeme a opláchneme v destilované vodě 3x1´. K dosažení

stejného účinku se může použít také vodní lázeň nastavená na 95°C s dostatečným

množstvím destilované vody, do které se vloží umělohmotné kyvety s potřebnými

roztoky (citrátový pufr-pH6, EDTA-pH8, TRIS/EDTA- pH9), po dostatečném vyhřátí

roztoků v kyvetách se přidají sklíčka a inkubují se 40 minut, po uplynutí této doby se

vyjmou a promyjí se v destilované vodě 3x1´. K dosažení obdobného účinku je

doporučován i autokláv a tlakový hrnec.

3.5 Blok imunních a neimunních vazeb (1,2,5,6)

Pro průkaz vazby antigenu a protilátky se běžně používají protilátky značené enzymem,

např. peroxidázou či alkalickou fosfatázou. Protože se tyto enzymy vyskytují také

přirozeně ve zpracovávané tkáni, mohou do značné míry znehodnotit výsledek vyšetření

ve smyslu falešně pozitivní reakce. Z toho vyplývá potřeba blokovat endogenní aktivity

enzymů. V případě použití peroxidázy použijeme jako substrát 0,3% roztok H2O2 v

methanolu nebo destilované vodě po dobu 20-30 minut. Při použití alkalické fosfatázy

blokujeme levamizolem. Pro blokování endogenního biotinu (řada tkání obsahuje

endogenní biotin, např. ledviny a játra) lze použít blok s 0,1-0,01% avidinem v PBS 20

minut a následně blok s 0,01-0,001% biotinem v PBS 20 minut.

Pozitivní barvení řezů není vždy výsledkem reakce antigen-protilátka, ale může být

následkem nespecifické reakce pozadí.

Mezi příčiny falešně pozitivní nespecifické reakce patří:

Aktivita endogenních tkáňových enzymů

Endogenní avidin-biotinová aktivita

21

Kontaminace řezů nebo reagencií cizorodými látkami

Hydrofobicita

Křížové reakce protilátky s podobnými epitopy na různých antigenech

Elektrostatická vazba- jejich vliv lze částečně eliminovat užitím pufrů s vyšší

iontovou silou

poškození řezu vedoucí k neadekvátní reaktivitě pozadí (např. řez nesmí během

zpracování vyschnout)

difuze tkáňových antigenních struktur do okolní tkáně

nespecifická reakce s Fc receptory imunoglobulinů přítomných ve tkáni

pohlcení antigenu fagocyty

nekróza tkáně

3.6 Vazba protilátek a detekčního systému (1,2,5,6)

Antigen v tkáni se váže s primární protilátkou, na primární protilátku sekundární, popř.

terciální protilátka, poslední protilátka je značená chromogenem, výsledkem je

přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke specifické vazbě, to znamená v místě, kde

se vyskytoval hledaný antigen. Pro úspěšnou detekci je třeba dodržovat podmínky

příbalového letáku protilátky (pH, typ fixace, ředění, doba inkubace atd.).

3.7 Vizualizace komplexu antigen-protilátka

Vazba antigenu s protilátkou v tkáních probíhá bez viditelné reakce. Abychom mohli

preparát pozorovat běžným světelným mikroskopem, je důležité k vizualizaci antigenu a

na něj navázaných molekul v preparátu použít dalších látek (1,5,6).

Podle toho, zda použijeme k vizualizaci antigenu chromogen nebo fluoreskující látku,

rozlišujeme v imunohistochemii 2 typy metod:

Imunofluorescenční- FITC (fluorescein-izokyanát), TRITC (tetramethyl-

rhodamin-izokyanát), deriváty rhodaminu B nebo texaská červeň.

Imunoenzymové- nejužívanějšími enzymovými markery jsou křenová

peroxidáza, alkalická fosfatáza, acetylcholinesteráza.

Při použití imunofluorescenční metody musíme mít k dispozici fluorescenční

mikroskop. Fluorochromy jsou barviva vykazující fluorescenci. Při fluorescenci je

22

http://www.marketatomsova.cz/odkazy/patologicka_anatomie_napln.pdf

světlo kratší vlnové délky (modré, fialové či UV) absorbováno a emitováno jako světlo

o delší vlnové délce. V excitovaném stavu molekula fluorochromu podléhá nevratným

konformačním změnám, kvůli nimž se tento děj nemůže u stejné molekuly opakovat.

Proto během excitace fluorochromu UV světlem intenzita emitovaného světla postupně

slábne (tzv. vysvícení). Imunofluorescenční metodiky se užívají zejména na

kryostatových preparátech, jako montovací médium se používá glycerinové medium

(1,5,6).

Pokud je detekční komplex značený peroxidázou (např. u metody SABC, ABC, PAP),

používáme jako chromogen 3,3´-diaminobenzidin (DAB). Křenová peroxidáza reaguje

se svým substrátem, kterým je peroxid vodíku. Oxidací původně rozpustného DABu,

který se této reakce účastní jako donor elektronů, vzniká stabilní hnědý produkt, který je

nerozpustný v alkoholu a proto se během dehydratace před montováním řezů nevyplaví.

Vedle DABu lze použít i jiné chromogeny, například 3-amino-9-ethylkarbazol (AEC)

karmínově červené barvy. V případě systému značeného alkalickou fosfatázou

používáme jako substrát naftol-AS-MX fosfát nebo Fast Blue BB či Fast Red,

výsledkem pak je červené, popřípadě modré zbarvení reakce. Nevýhodou AEC je však

rozpustnost reakčního produktu v alkoholu, díky čemuž je nutné montovat řezy do

hydrofilního média (1,5,6).

3.8 Dobarvení tkáně

Barvením pozadí v imunohistochemickém preparátu se rozumí dobarvování jader a to

pro lokalizaci pozitivní reakce vůči okolním známým strukturám preparátu. K tomuto

účelu se používá například Harrisův hematoxylin, Mayerův hematoxylin, Gillův

hematoxylin.

3.9 Dehydratace a montáž preparátu

Řezy se odvodní řadou alkoholů, projasní karbolxylenem a xylenem a zamontují se do

příslušného média- kanadský balzám, solakryl nebo syntetická pryskyřice.

23

4 Hybridizace in situ

In situ hybridizace (používá se označení ISH) je metoda dovolující přesnou

identifikaci a lokalizaci specifických sekvencí nukleových kyselin (DNA či RNA)

pomocí komplementární oligo- či polynukleotidové označené sondy - próby. V

histologii se používá na parafinových řezech, dále také na buněčných nátěrech nebo na

řezech z kryostatu (5).

Metoda hybridizace in situ (ISH) byla vyvinuta v roce 1969, tehdy jako metoda

užívající izolovanou a purifikovanou nukleovou kyselinu značenou radioizotopy. Až v

roce 1985 však bylo pro detekci specifické sekvence mRNA poprvé použito

syntetických oligonukleotidů komplementárních k hledané sekvenci.

Vizualizace reakčního produktu je tedy možná dvojím způsobem- metodou s použitím

radioizotopů navázaných na sondu a neizotopovou. Detekční metody jsou přímé nebo

nepřímé (5).

4.1 Přímá metoda(5)

Přímá metoda užívá sond, které jsou přímo konjugované s markerem (radioizotopem,

fluorochromem či enzymem) a to tak, že sonda po hybridizaci může být bezprostředně

vizualizována. Nevýhodou je nízká citlivost při užití neradioaktivního způsobu značení,

při užití radioizotopů menší cílenost (a rizika vyplývající z práce s radioizotopy).

4.2 Nepřímá metoda (15)

Na jedinou sondu se naváže větší množství markerů, čímž se velmi zvýší senzitivita.

Sonda bývá konjugována s linky, které se napojí na molekuly nesoucí markery.

Interakce mezi linkem a markerem jsou založeny na specifické vazbě mezi antigenem a

protilátkou, nebo na vazbě biotinu s avidinem/streptavidinem.

Enzymatické značení nukleových kyselin biotinem je velmi rozšířené. K jeho

vizualizaci lze použít protilátky proti biotinu, ale častěji to bývá streptavidin nebo

avidin.

Fluoresceinem značené sondy mohou být použity v přímých i nepřímých hybridizačních

metodách. V přímé metodě není potřeba k vizualizaci dalších kroků, ale citlivost je nižší

než při použití metod nepřímých.

24

Ribonukleová kyselina RNA je nukleová kyselina skládající se z vlákna

kovalentně navázaných nukleotidů. Od deoxyribonukleové kyseliny DNA se liší

přítomností hydroxylové skupiny, připojené ke každé pentózové molekule řetězce, ale

také využitím nukleové báze uracilu místo thyminu. Je obvykle jednovláknová, ale

někdy také dvouvláknová. RNA má v těle mnoho funkcí, rozlišujeme mnoho různých

podtypů. Mediátorová RNA (mRNA) vzniká transkripcí DNA a přenáší genetickou

informaci na místo,kde poté dojde k jejímu přeložení neboli translaci na výsledný

protein. Stavební funkci v ribozomu nebo má rRNA a tRNA zajišťuje transport

aminokyselin k ribozomu. Samozřejmě existuje mnoho dalších druhů RNA.

Hlavním problémem při izolaci RNA jsou RNázy - velmi odolné enzymy štěpící RNA.

Všechny vodné roztoky i materiál, které přijdou do styku se zpracovávaným vzorkem

musí být zbaveny RNáz. Pro izolaci můžeme použít fenol-chloroformovou extrakci,

fenol musí mít vyšší teplotu a musí být kyselý. Získáme roztok všech typů RNA-

celkovou RNA, který lze zbavit kontaminující DNA působením DNázy. Nejčastěji je

cílem izolace získání samostatné mRNA.

Deoxyribonukleová kyselina DNA je tvořena dvěma polynukleotidovými řetězci

spojenými vodíkovými můstky. V každém řetězci se střídá cukerná jednotka

deoxyribóza se zbytkem kyseliny fosforečné- fosfátem. Na deoxyribózu je po straně

připojena báze. Deoxyribóza, fosfát a báze tvoří nukleotid, který je základní jednotkou

DNA. Na místě báze se mohou v DNA vyskytnout čtyři různé heterocyklické

sloučeniny. Dvě z nich jsou odvozeny od struktury purinu- adenin a guanin a dvě od

pyrimidinu- thymin a cytosin, proto existují i čtyři různé nukleotidy-

deoxyadenosinfosfát, deoxytymidinfosfát, deoxyguanosinfosfát a deoxycytidinfosfát.

Polymerní molekula DNA je chemickým podkladem dědičnosti. Genetická informace je

v DNA zapsána v pořadí bází. Dvouřetězcová struktura DNA je pro uchování genetické

informace výhodná, jelikož je stabilnější a lépe odolává vnějšímu poškození.

Dva řetězce DNA jsou jsou spojeny vodíkovými můstky mezi purinovými a

pyrimidinovými bázemi do pravotočivé dvoušroubovice. Dvouřetězcová struktura DNA

ovšem není stabilizována pouze vodíkovými můstky (i množství vodíkových můstků je

větší), ale také sendvičovým uspořádáním bází a dalšími interakcemi.

Vysokomolekulární DNA taje dokonale až při teplotě 94-96°C. Dochází k úplnému

25

rozdělení na dvě vlákna, tomuto procesu říkáme denaturace DNA, jelikož molekula

ztrácí své přirozené uspořádání. K prvním změnám dochází už při teplotách mezi 50 a

60°C, ale denaturace je úplná až při 94-96°C (platí pro velké molekuly DNA). Z toho

vyplývá, že jde o postupný proces. Tepelné pohyby atomů totiž při nižší teplotě nejdříve

pouze částečně rozpohybují části molekuly. Teprve když dojde k překročení mezního

bodu oddálení atomů, které se podílejí na tvorbě vodíkového můstku, dochází k jeho

zániku. Pokud přísun energie nepokračuje, dochází opět k jeho obnovení. Úplný zánik

konkrétních vodíkových můstků tedy nastává až při stálém překročení určité kritické

teploty. Nejdříve zaniká vazba mezi adeniny a thyminy, protože pár A-T je stabilizován

pouze dvěma vodíkovými můstky. Až při vyšší teplotě zaniká vazba mezi guaniny a

cytosiny, která je stabilizována třemi vodíkovými můstky. Pokud v některé části

molekuly převažují A-T páry, je méně stabilní a denaturuje už při nižší teplotě. Naopak

úseky DNA bohaté na G-C páry jsou velmi stabilní a denaturují až při velmi vysokých

teplotách.

V molekulární genetice jako sondu označujeme molekulu nukleové kyseliny, kterou

použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA.

Využíváme při tom schopnost jednovláknových molekul nukleových kyselin

hybridizovat (tvořit hybridní molekuly), pokud obsahují komplementární sekvence. Z

této schopnosti vyplývá i využití sond - tyto molekuly hybridizují s vyšetřovanou

nukleovou kyselinou za určitých podmínek jen v případě, že obsahuje komplementární

sekvenci. Sondu si můžeme připravit tak, aby měla potřebnou sekvenci. Sondami tedy

můžeme vyšetřovat přítomnost konkrétní sekvence ve vzorku nukleových kyselin.

Můžeme tedy pomocí sond například vyšetřit přítomnost chorobné nebo zdravé alely

genu, nebo sledovat intenzitu exprese určitého genu v určité populaci buněk.

Hybridizovat mohou pouze jednovláknové molekuly. Pokud je sonda nebo vyšetřovaná

nukleová kyselina dvouvláknová molekula, musí být nejdříve denaturována. Pro

hybridizaci jsou pak nutné stejné podmínky, jako pro renaturaci denaturované DNA-

tyto podmínky musejí umožňovat vznik stabilních vodíkových můstků mezi sondou a

vyšetřovanou nukleovou kyselinou. Na stabilitu vodíkových můstků má vliv teplota a

koncentrace iontů. Pokud bude teplota nebo koncentrace iontů v hybridizačním roztoku

nižší, bude hybridizace probíhat lépe, protože budou vodíkové můstky mezi molekulami

vyšetřované nukleové kyseliny a sondy stabilnější. Pokud bude naopak teplota nebo

26

koncentrace iontů vyšší, bude hybridizace probíhat pomaleji popřípadě neproběhne

vůbec, jelikož tepelná energie a ionty zabrání vzniku stabilních vodíkových můstků.

Pokud by ale byla teplota nebo koncentrace iontů příliš nízká, stačilo by ke stabilizaci

hybridní molekuly sonda-vyšetřovaná nukleová kyselina pouze několik vodíkových

můstků. Pak by docházelo k hybridizaci i mezi molekulami, které nejsou přesně

komplementární. Podmínky hybridizace proto musejí být dostatečně přísné, aby byly

stabilní jen přesně spárované hybridní molekuly. Pouze v tom případě je výsledek

hybridizace spolehlivý a může z něho být vyvozen závěr o přítomnosti nebo

nepřítomnosti komplementární sekvence ve vyšetřovaném vzorku nukleové kyseliny.

Prakticky se hybridizace nejčastěji provádí tak, že se umožní nasednutí sondy za

podmínek upřednostňujících přesné nasedání, ale které nejsou natolik přísné, aby příliš

snižovaly účinnost nasedání (obvykle 65-68°C ve vodném roztoku nebo 42°C v 50%

formamidu). Vzorek je promýván pufrem o nízké koncentraci iontů při vysoké teplotě

(5-25°C pod teplotou tání sekvence sondy), takže dojde k odmytí nepřesně

hybridizovaných molekul sondy a na vyšetřované DNA se udrží jen sondy dokonale

komplementární. Pro hybridizaci se používají dvouvláknové DNA-sondy, nebo

jednovláknové RNA-sondy. Vyšetřovaná nukleová kyselina může být také

dvouvláknová DNA, nebo jednovláknová RNA. Pakliže jsou některé z molekul

dvouvláknové, musíme je před hybridizací nejdříve denaturovat - místo působení

vysoké teploty se obvykle používá chemický roztok s denaturačním činidlem (např.

močovina nebo formamid). Při vlastní hybridizaci nejprve smísíme sondu s

vyšetřovanou nukleovou kyselinou a zajistíme vhodné podmínky pro hybridizaci.

Poté je potřeba odmýt sondu, která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou kyselinu,

abychom zviditelnili pouze sondu navázanou na vyšetřovanou DNA. Je nutné, aby

vyšetřovaná nukleová kyselina byla přichycena k pevnému podkladu, výhodou je nejen

možnost odmýt nenavázanou sondu, ale také působit v průběhu hybridizace, i při

následné detekci značené sondy na přichycenou nukleovou kyselinu různými roztoky.

Pokud má hybridizace skutečně proběhnout jen mezi přesně komplementárními

sekvencemi ve vyšetřované nukleové kyselině a v sondě, nestačí pouze jeden krok.

Nejprve se sonda nechá nasedat v méně přísných podmínkách, kdy může nasednout i na

ne zcela přesně komplementární sekvence, roztoky se postupně vyměňují a podmínky se

více zpřísňují, až se na vyšetřované nukleové kyselině udrží jen ta sonda, která se

navázala všemi svými vodíkovými můstky- je nejstabilnější. Každý typ sondy vyžaduje

27

specifické mírné úpravy základního protokolu. Komerčně vyráběné próby jsou

dodávány s doporučeným pracovním návodem.

Fixace materiálu pro hybridizace in situ- DNA ani RNA nereagují s fixativy jako

formalin, takže formolem fixované a do parafínu zalité bloky můžeme k hybridizaci

použít. Také kryostatové řezy je možné fixovat ve formolu nebo parách formaldehydu.

Podložní skla se doporučuje potřít silanem, popřípadě poly-L-lysinem, aby se během

hybridizace minimalizovalo riziko ztráty řezů.

4.3 Obecná pravidla při hybridizaci in situ

Pracujeme v rukavicích, v žádném případě se nedotýkáme rukama ani sklíček,

ani pracovních pomůcek pro hybridizaci z důvodu kontaminace materiálu.

Umyté a usušené použité sklo se zabalí do alobalu a dá se do termostatu na 2

hodiny na 150°C, sklo musí být před použitím sterilní, stejně tak jiné použité

pomůcky jako jsou pipety nebo váženky.

Příslušné roztoky uchováváme v lednici při 4°C

4.4 Příklad hybridizace in situ- Detekce HPV kitem DAKO

Nakrájené řezy necháme usušit v termostatu přes noc při 37°C

Deparafinujeme

3x opláchneme redestilovanou vodou, osušíme buničinou

Vložíme do plastové kyvety s roztokem Target retrieval solution – 45 ml aqua

pro injectione+ 5 ml Targetu po dobu 40 minut, který se zahřál v předem vyhřáté

vodní lázni na 95°C

Kyvetu vyjmeme a necháme zchladnout při pokojové teplotě po dobu 20 minut,

roztok zbělá

5x krátce opláchneme v redestilované vodě, dokud roztok nepřestane pěnit

Natrávíme v pepsínu- 2,5 mg + 25 ml 0,2 N HCl při RT 13 minut

Oplach v redestilované vodě 3x1 minuta

28

Obrázek 6-PRINCIP HYBRIDIZACE IN SITU

Blokování endogenní peroxidázy- 0,3 % H2O2+ 100% methanol 20 minut RT

3x krátce opláchneme v redestilované vodě

3 minuty aqua pro injectione

Nechat úplně uschnout

Nakapat proby, přikrýt krycím sklem

Péct v termostatu při 90°C 5 minut

Ve vlhké komoře necháme inkubovat v termostatu při 37°C do druhého dne

Příprava stringentního mytí- Stringent wash naředíme 50x- 49ml redestilované

vody + 1 ml roztoku, skleněnou kyvetu s roztokem vložíme na vytemperování

na 55-58°C do vodní lázně

Připravíme si TBST- z redestilované vody připravíme fyziologický roztok-

500ml redest.+4,16 g NaCl, koncentrovaný TBST

450 ml fyziologického roztoku + 50 ml koncentrovaného TBST –

změříme pH- rozmezí 7,2-7,4, popřípadě upravíme konc. Kyselinou

chlorovodíkovou

Uvolníme krycí skla v TBST, oplach v TBST 3x2 minuty

Skla vložíme do vodní lázně na 20 minut

Oplach v TBST 3x2 minuty

Primární STREPTAVIDIN- HRP- ředěný 200x – kit fa DAKO 15 minut

Oplach TBST 3x2 minuty

BIOTINYL TYRAMIDE neředěný - kit fa DAKO


Secondary STREPTAVIDIN-HRP neředěný- kit fa DAKO 15 minut


DAB- ředěný 50x – kit fa DAKO 8 minut

Oplach vodou

Dobarvení Harrisovým hematoxylinem 1 minutu, oplach čpavkovou vodou do

zmodrání jader

Odvodnění, projasnění, montování

Odečtení lékařem

29

5 Imunohistochemie v praxi

Jako příklad uvádím imunohistochemický postup detekování Glypicanu-3(GPC 3). Pro

průkaz GPC 3 používáme myší monoklonální protilátku z ascitu, naředěnou

fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, pH 7.4, s proteinovou bází a

konzervovanou azidem sodným. Glypican-3 je glykosylfospatidylinositol ukotvený

membránový protein, který se nachází také ve formě sekretu. Byl identifikován jako

užitečný nádorový marker při diagnózách jako je například hepatocelulární karcinom

(HCC), hepatoblastom, melanom, nádory zárodečných center varlat a Wilmsovy nádory.

U pacientů s HCC byl GPC3 nadměrně exprimován v neoplastické tkáni jater a v séru

byly jeho zvýšené hladiny, avšak nebyl detekován v normálních játrech, játrech

s benigními nádory a v séru zdravých dárců. Bylo také prokázáno, že exprese GPC3 je

vyšší v tkáni jater s HCC než v játrech s cirhózou nebo v játrech s fokálními lézemi,

jako například dysplastické uzliny a oblasti hepatického adenomu (HA) s maligní

transformací. Vysoké hladiny exprese GPC3 byly také nalezeny v některých typech

embryonálních nádorů, například Wilmsův nádor a hepatoblastom, s nízkou nebo

nedetekovatelnou expresí v normální přilehlé tkáni. Tyto studie shodně ukazují, že

GPC3 je důležitým nádorovým markerem (10).

Postup: deparafinace- 3x xylen, 3x 96% alkohol, 70% alkohol

zavodnění- oplach destilovanou vodou

natrávení tkáně ve vodní lázni 95°C 60 minut

oplach destilovanou vodou

blokování endogenní peroxidázy methanolem s 0,3% peroxidem vodíku-

30 minut

oplach destilovanou vodou 3x5 minut

oplach fosfátovým fyziologickým roztokem- FFR

aplikace primární protilátky ředěné v Antibody diluent fa DAKO,

ředění 1:100, inkubace v lednici 4°C přes noc ve vlhké komoře, která

zabraňuje vyschnutí protilátky na podložním sklíčku

oplach FFR 3x5 minut

aplikace sekundární protilátky Histofine Simple Stain fa NICHIREI

BIOSCIENCES 30 minut

30

oplach FFR 3x5 minut

aplikace chromogenu- aplikace koncentrovaného AEC fa DAKO 15 minut

oplach pod tekoucí vodou

dobarvení jader Mayerovým hematoxylinem 10 minut

praní v tekoucí vodě 10 minut

montování do kamencové želatiny, necháme zaschnout

vyhodnocení preparátů-světelným mikr.- jádra- modrá

GPC3 v cytoplasmě- červená

V současné době se kromě ruční imunohistochemické analýzy využívá také moderního

barvícího systému ve strojích speciálně určených k imunohistochemické analýze.

Jako příklad bych chtěla uvést BenchMark ULTRA od firmy Ventana.

Barvící systém BenchMark ULTRA je určen pro automatické barvení

histologických nebo cytologických vzorků na mikroskopických sklíčkách se

specifickými imunohistochemickými nebo in situ hybridizačními reagenciemi pro

diagnostické použití in vitro. Tento přístroj plně automatizuje postupy sušení,

deparafinace a barvení. Systém může spouštět pouze proškolený laboratorní personál,

jako např. histologičtí technologové a laboratorní pracovníci s odbornými znalostmi

histologických procesů, kteří mají základní uživatelské dovednosti v oblasti výpočetní

techniky (13).

Hlavní výhody systému:

libovolné zpracování-obarví jakékoliv sklíčko při jakémkoliv postupu nezávisle

na stavech či postupech jiných sklíček

trvalý přístup-za chodu, kdy probíhá zpracování sklíček, lze přidávat nová

sklíčka ke zpracování a vyjímat zpracovaná sklíčka. Chcete-li přidat nebo

vyjmout reagencie, můžete naplánovat přestávku vypočítanou systémem tzv.

parkovací interval. Parkovací intervaly jsou prodlevy, kdy se přístroj může

zastavit a znovu uvést do chodu, aniž by byla dotčena sklíčka, která se právě

zpracovávají.

Modularita-lze přidat barvící systémy podle kapacitních možností nebo potřeb

laboratoře.

31

Flexibilita-optimalizuje protokoly, reagencie a termíny k usnadnění správné

laboratorní praxe a fixace tkání.

Dvě hlavní složky systému tvoří počítač se softwarem a barvící přístroj. Software lze

napojit až k osmi přístrojům, ale zároveň všechny přístroje můžeme sledovat a řídit z

jediné pracovní stanice. Snímače přístrojů načítají čárové kódy sklíček a reagencií,

kontrolují kapaliny, sledují průběh zpracování sklíček a tyto údaje se předávají počítači.

Počítač plánuje barvící cyklus a sděluje obsluze, které reagencie má vložit. Informuje

obsluhu, kde se právě nachází každé sklíčko v průběhu zpracování, kterou nádobu na

reagencie je třeba vyjmout nebo naplnit a kdy je nutno vyprázdnit odpadní nádoby.

Ohlašuje problémy, potřeby nebo chyby na panelu pro zobrazování hlášení a obsluha si

může jednoduše zobrazit údaje o daném sklíčku popřípadě o reagencii. Detailně Systém

BenchMark ULTRA obsahuje barvící zařízení, počítač s instalovaným systémovým

softwarem, počítačový monitor s plochou obrazovkou, tiskárnu štítků, paměťové

médium připojované k USB, myš, sondu registrace produktu a kanystry. Barvící přístroj

obsahuje zásobníky sklíček, systém k dávkování reagencií, velkoobjemové reagencie a

odpadní nádoby. Všechny reagencie, sady, protilátky a velkoobjemové produkty

společnosti Ventana jsou baleny s paměťovým médiem, které je připevněno k nádobě.

Reagencie lze zakoupit nejen u společnosti Ventana, ale produkty jiných dodavatelů

musí být registrovány v systému Ventana, jinak s nimi nelze pracovat v systému

BenchMark ULTRA (13).

Rutinní barvící cyklus se zahájí výběrem barvícího protokolu vytištěním štítků na

sklíčka a vložením sklíček a příslušných reagencií do přístroje. Barvící protokol je sada

reagencií a pokynů k použití- aplikace enzymů, inkubační doby protilátky atd.

Protokoly se mohou nadefinovat a uložit. Poté se dle potřeby spojí s objednávkami

pacientů. Štítky sklíček obsahují čárový kód, který identifikuje protokol. Na štítek lze

vytisknout dodatečný text pro osobní potřebu. Reagenční dávkovače obsahují

předtištěný čárový kód, sloužící ke stanovení pozic reagencie v přístroji. Po vložení

sklíček a reagencií tlačítkem zahájíme cyklus. Přístroj načte čárové kódy na

dávkovačích a štítcích na sklíčkách. Software přiřadí reagencie a sklíčka k protokolu a

naplánuje barvící cyklus. Pokud protokol vyžaduje reagencii, která není v karuselu

reagencií, operátor obdrží zprávu pomocí zvukového znamení a současně se objeví

zpráva i na monitoru počítače. Důležitý je samostatný přístup k zásobníkům sklíček.

32

Zásobníky plní svou funkci samostatně, takže se mohou vkládat a vyjímat sklíčka

nezávisle na ostatních.

Díky nepřetržitému přístupu můžeme kdykoliv dávkovat cykly protilátek, přidávat nové

objednávky, vyjímat ukončená sklíčka a okamžitě zahájit další cykly (13).

Rozšířený barvící systém BenchMark ULTRA velmi zjednodušuje a urychluje práci v

imunohistochemické laboratoři a snížením četnosti manuálního kontaktu laboratorních

pracovníků se sklíčky se zvyšuje bezpečnost a minimalizují chyby.

Abychom zjistili možné chyby barvícího systému, tak se s každým provedeným

barvícím postupem provede pozitivní tkáňová kontrola. Řez na pozitivní kontrolu se

vloží na stejné sklíčko jako pacientova tkáň. Tento postup pomáhá zjistit případy, kdy

na preparát s testovaným vzorkem pacienta nebyla omylem nanesena primární protilátka

nebo jiná důležitá reagencie. Kontrolní vzorky by měly být čerstvé, odebrané při pitvě,

biopsii nebo chirurgickém zákroku, co nejdříve fixované jako testované řezy.

Pokud pozitivní tkáňová kontrola neposkytne pozitivní zabarvení, je nutno považovat

výsledky vzorků pacienta za neplatné a musíme barvící proces opakovat (13).

Obrázek 6-BARVÍCÍ PŘÍSTROJ BENCHMARK ULTRA (20)

33

Jako příklad bych chtěla uvést náš protokol barvení na GLYPICAN 3 ve stroji

BenchMark ULTRA(13):

Protokol pro průkaz glypicanu 3 ( Gly 3 Red)Procedura: U ultraView Red (červená)BenchMark ULTRA IHC/ISH Staining Module

Institut klinicke a transplantacni patologie, Videnska 1958/9 Praha 4Krok č Krok procedury

1 Povolit mixéry

2 Zahřát skla na [66 st. C] a inkubovat po dobu [4 minuty] ( Sušení )

3 Vyřadit mixéry

4 [ Nastavit teplotu na 72 °C jako výchozí ]

5 Ohřát sklíčka na [72 st. C] z Medium Temperatures ( Odparafínování )

6 Inkubovat po dobu 4 minuty

7 Aplikovat EZPrep úprava objemu

8 Opláchnout sklíčko pomocí EZ Prep


10 Aplikovat krycí vrstvu





15 Upravit objem pomocí Depar Volume Adjust


17 Povolit mixéry

18 Vypnout vyhřívání sklíček

19 Bod pozastavení (Parkovací interval)

20 [ Krátká - 8minutová úprava ]


22 Aplikovat kondicionér dlouhých buněk č.1

23 Aplikovat CC krycí sklíčko, dlouhé

24 [ Nastavit teplotu na 95 °C jako výchozí ]

25 Zahřát skla na [95 st. C] a inkubovat po dobu 8 minut ( Kondicionér buněk č.1 )

26 Aplikovat kondicionér buněk č.1

27 Aplikovat CC střední krycí sklíčko, bez BB




34

31 [ MILD ]

















48 [ STANDARD ]



51 Aplikovat krátký kondicionér buněk č.1





56 Inkubovat po dobu 8 minut

57 Opláchnout sklo reakčním pufrem

58 Upravte objem na sklíčku přidáním reakčního pufru





63 Bod pozastavení (Parkovací interval)

64 Zahřát skla na 36 °C




68 Zahřát skla na [37 st. C] a inkubovat po dobu 4 minuty ( Protilátka )




35

72 Hand Apply ( Primární protilátka ), and Incubate for [0 h 48 min]

73 Zahřát skla na 36 °C



76 Aplikovat jednu kapku UV Red UNIV MULT, zakrýt a inkubovat po dobu 12 minut






82 Aplikovat jednu kapku UV Red Enhancer, zakrýt a inkubovat po dobu 4 minuty

83 Aplikovat jednu kapku UV Fast Red A a jednu kapku UV Red Naphthol a inkubovat po dobu

8 minut

84 Aplikovat jednu kapku UV Fast Red B a inkubovat po dobu 8 minut



87 Aplikovat jednu kapku [HEMATOXYLIN II] (Jádrové barvení ), zakrýt a inkubovat po dobu [8

minut]






93 Aplikovat jednu kapku [BLUING REAGENT] (Po jádrovém barvení), zakrýt a inkubovat po

dobu [4 minuty]





Vyndáme ze stroje, opláchneme v jarové vodě, odvodníme, projasníme, zamontujeme například

do kanadského balzámu

36

Obrázek 7- UKÁZKA GPC3 (21)


37


6 Dvojité imunohistochemické barvení (Double staining)

6.1 Postupné imunoenzymové dvojité barvení (18)

Způsob postupného dvojitého barvení je založen na dvou samostatných, následně

provedených kompletních postupech s nebo bez vymývání protilátek mezi oběma

postupy. Postup je plně nezávislý na druhu primární protilátky, Ig typu nebo Ig izotopu.

Pokud chceme dělat dvojité barvení ručně, musíme přidat některé kroky do základního

postupu.

Po blokování endogenní peroxidázy postupujeme takto:

1. Blokování nespecifických vazeb, sklepnutí, bez oplachu 15 min

2. myší nebo králičí protilátka 1, oplach přes noc 4 C nebo 30-60´

3. EnVision/HRP, GAM (Goat anti Mouse)+GAR (Goat anti Rabbit) ,oplach 30´

4.DAB 2-10´

5. Vymývací krok s DAKO „double staining block“ 30´


38

7. myší nebo králičí protilátka 2, oplach přes noc 4 C nebo 30-60´

8. EnVision/AP, GAM/GAR, oplach 30´

9. Fast Red (New Fuchsin, Fast Blue BB) 5-30´

6.2 Současné imunoenzymové dvojité barvení (18)

Přímý postup je založený na současné aplikaci dvou přímo značených primárních

protilátkách.

Příklad:


2. Mab1/ konjugát 1 + Mab2/konjugát2 přes noc 4 C nebo 60´

3. po oplachu jsou další detekční kroky závislé na značení prim. Ab

první detekce enzymové aktivity, oplach

4. druhá detekce enzymové aktivity, oplach

V současnosti u nás používaný barvící systém BenchMark ULTRA firmy Ventana

detekuje i 2 různé antigeny na jedné vyšetřované tkáni.

Jako příklad uvádím detekci D2-40+AE1/3, kdy ve výsledku je pozitivita D2-40

zbarvena hnědě a AE1/3 červeně. Přidávám zkrácený postup stroje BenchMark

ULTRA(13).

IHC DS uDAB-uRed

BenchMark ULTRA IHC/ISH Staining Module

D2-40+AE1/3

1 Sušení [Zvoleno]

2 Zahřát skla na [66 st. C] a inkubovat po dobu [4 minuty] ( Sušení )

3 Odparafínování [Zvoleno]

4 Ohřát sklíčka na [72 st. C] z Medium Temperatures ( Odparafínování )

5 Kondicionování buněk [Zvoleno]

6 ULTRA Conditioner #1 [Zvoleno]

7 Zahřát skla na [95 st. C] a inkubovat po dobu 8 minut ( Kondicionér buněk č.1 )

8 20 minut při použití lahve ULTRA CC1 [Zvoleno]


39


11 Teploty inkubace protilátky [Zvoleno]

12 Zahřát skla na [37 st. C] a inkubovat po dobu 4 minuty ( Protilátka )

13 Protilátka [Zvoleno]

14 Aplikovat jednu kapku ( Protilátka ), zakrýt a inkubovat po dobu [36 min]

15 Denaturace protilátky [Zvoleno]

16 Zahřát skla na [90 st. C] a inkubovat po dobu [4 minuty] ( Denaturace )

17 DS Inkubační teploty protilátky [Zvoleno]

18 Zahřát skla na [37 st. C] a inkubovat po dobu 4 minuty ( DS Protilátka )

19 DS Protilátka [Zvoleno]

20 Aplikovat jednu kapku [PREP KIT 2] ( DS Protilátka ), zakrýt a inkubovat po dobu

[0 h 24 min]

21 Jádrové barvení [Zvoleno]

22 Aplikovat jednu kapku [HEMATOXYLIN II] ( Jádrové barvení ), zakrýt a inkubovat

po dobu [8 minut]

23 Aplikovat jednu kapku [BLUING REAGENT] ( Po jádrovém barvení ), zakrýt a

inkubovat po dobu [4 minuty]

Vyndáme ze stroje, opláchneme v jarové vodě, odvodníme, projasníme, zamontujeme

například do kanadského balzámu.

40

Obrázek 10- UKÁZKA DVOUBAREVNÉHO IMUNA- angioinvaze karcinomu tlustého střeva (AE1/3

červeně) do lymfatické cévy (D2-40- hnědě) (21)

Obrázek 11- HNĚDĚ BK VIRUS, ČERVENĚ C4d POZITIVITA (21)

41

7 Závěr:

Cílem této práce bylo zvýšit povědomí a informovanost o imunohistochemii a jejím

přínosu pro oblast klinické diagnostiky a dalších oblastí zdravotnictví. Za mnoho let

svého vývoje se stala jednou z nejdůležitějších metod pro určování správných diagnóz

ve zdravotnictví a je jejich nezbytnou součástí. Imunohistochemie se neustále vyvíjí a

lze očekávat její další rozvoj pro klinickou praxi i potřeby výzkumu.

42

SEZNAM OBRÁZKŮ:

Obrázek 1- Protilátka str. 9

Obrázek 2- Výroba monoklonální protilátky str. 10

Obrázek 3- Zvířata pro výrobu protilátek str. 11

Obrázek 4- Metoda ABC str. 13

Obrázek 5- Znázornění metod str. 14

Obrázek 6- Barvící přístroj BenchMark ULTRA str. 34

Obrázek 7- Ukázka GPC 3 str. 37



Obrázek 10- Ukázka dvoubarevného imuna str. 41

Obrázek 11- Hnědě BK virus, červeně C4d pozitivita str. 41

43

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ZDROJŮ INFORMACÍ:

(1) Gomolčák, Pavol. Základy imunohistochémie v patológii. Brno: Institut pro další

vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 1997.

ISBN 80-7013-239-6

(2) Lukáš, Z. a kol. Imunohistochemické metody v biologii a v bioptické diagnostice.

Brno: Lékařská fakulta Masarykovy univerzity v Brně, 1997.

ISBN 80-210-0620-X

(3) Ambrosius H., Luppa H.: Immunohistochemie. Berlín: Springer Verlag, 1987

ISBN 3-05-500316-0

(4) Maňáková E., Seichertová A.: Metody v histologii. Praha: Karolinum, 2001

ISBN 80-246-0230-X

(5) MUDr. Beranová, Milena, Ph. D., Mgr. Tonar Zbyněk. Principy a příklady

imunohistochemie. [online]. Plzeň: LF UK, Ústav histologie a embryologie,

2002 [cit. 23. ledna 2011]. Dostupné na WWW:

<www.lfp.cuni.cz/histologie/education/guides/ihc/node4.html>,



<www.lfp.cuni.cz/histologie/education/guides/ish/node8.html>

(6) Prezentace [online]. [cit. 20.ledna 2011]. Dostupné na WWW:

<http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/12_Imunohistochemie.pdf>

(7) Biolab. Immunohistochemie [online]. Praha: Biolab, Plzeňská [cit. 20. ledna

2011]. Dostupné na WWW: <www.biolab.cz/imunohistochemie.php>

44

(8) Vašínová, Lenka. Zavedení imunohistochemické detekce mikrometastáz

karcinomu prsu.[online]. Brno: Masarykova univerzita, Lékařská fakulta, 2009

[25. ledna 2011]. Dostupné na WWW:

<is.muni.cz/th/215068/lf_b/Imunohistochemie_Lenka_Vasinova.docx>

(9) Nicherei, N-Histofine Simple Stain Max. [online]. Exbio [26. ledna 2011].

Dostupné na WWW:

<http://www.exbio.com/pdfcz/histofineMAXPO_multi.pdf>

(10) Cell Marque, Glypican 3 [online] Quarion [cit. 2. února 2011]. Dostupné

na WWW: <http://www.e-labeling.eu/CMC26129021/CS>

(11) Průša, Richard a spol. Učebnice biochemie [online] Praha. [10. února

2011]. Dostupné na WWW:

<http://www.lf2.cuni.cz/Projekty/prusa-DNA/newlook/defa4.htm>

(12) Raclavský, V., MUDr., Ph.D. [online] Olomouc 2003. [10. 4. 2011]

Dostupné na WWW: <http:/ /biologie.upol.cz/metody/>

(13) Ventana systeme software, BenchMark ULTRA. 2009

(14) Finferlandův ústav patologie, Lékařská fakulta UK a Fakultní nemocnice

[online] Dostupné na WWW:

<www.fingerland.cz/img/vyuka/bak/1_Spoluprace.ppt>

(15) Voet D., Voetová J.: Biochemie. Praha: Victoria Publish, 1995

ISBN 80-85605-44-9

(16) Dostupné na WWW: <http://i2.squidoocdn.com/resize/squidoo_images/-

1/lens16691151_1292842974antibody.gif>

(17) Dostupné na WWW:

<http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/monoclonal.gif>

(18) RNDr. Alena Lodererová, Transplantační patologie, IKEM


<www.biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/12_Imunohistochemie.pdf>

45

http://biologie.upol.cz/metody/Pouziti%20sond.htm

http://www.lf2.cuni.cz/Projekty/prusa-DNA/newlook/defa4.htm


<http://www.roche-diagnostics.hu/fmfiles/re7193001/Hungary/roche.hu/

Diagnostic/Termekek/BenchMark_ULTRA/ultra.jpg>

(21) MUDr. Eva Honsová, Transplantační patologie, IKEM

46

Date post:	02-Jan-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

portal.szspraha1.czportal.szspraha1.cz/szs/portal.nsf/0/438D7E7832EFCAE3C... · Web viewZáklady...

Documents