SvoziloviSvozilovianebaneb

jak vyšetřujeme Alportův jak vyšetřujeme Alportův syndromsyndrom

SvoziloviSvozilovianebaneb

jak vyšetřujeme Alportův jak vyšetřujeme Alportův syndromsyndrom

Zpracovala: A. Lukášová a jiníZpracovala: A. Lukášová a jiní

Co řekl Kubík Svozil

Čtyřletý Kubík Svozil dostal v listopadu kašel a rýmu.„Mami, já asi čůrám pivo!“podivil se, když se podíval do nočníku. A opravdu, v nočníku bylo na dně trochu tekutiny a vypadala jak černé pivo. Asi čtrnáctka.

Co si řekla maminka Svozilová

Řekla si: To budou ledviny! Kubík si nachladil ledviny!

A na co si maminka Svozilová vzpomněla

Nejdřív si vzpomněla:Bratr Karel umřel na ledviny a bylo mu sotva 43 let! A ještě k tomu byl hluchý.

A pak si vzpomněla:I mě zjistili krev v moči, ale maminka mi říkala, že to má taky a že to nic není. A měla pravdu – dožila se 86 let.

Půjdeme k lékaři!!!

Co řekl nefrologNefrolog řekl: Kubík má v moči krev, ale funkce ledvin je v pořádku. Přesto soudím, že by to mohl být Alportův syndrom.

?

A vysvětloval……………………………………………

Nefrologovo vysvětlení• Alportův syndrom je porucha kolagenu IV v bazálních

membránách ledvinných klubíček, v kůži, v oku a ve vnitřním uchu. Asi proto Váš bratr ohluchl a pak zemřel na selhání ledvin.

• Většinou je porucha v genu na chromozomu X, ženy porušený gen přenášejí, ale k selhání ledvin u nich nedochází. Vy i Vaše maminka jste sice měly krev v moči, ale funkce Vašich ledvin byla normální. U mužů může dojít k plnému rozvoji onemocnění – k hluchotě, poruchám vidění a selhání ledvin.

Nemoc může potvrdit pouze vyšetření na patologii!

Jak se nakonec dohodli

1. Uděláme biopsii kůže a provedeme imunofluorescenční vyšetření řetězců kolagenu IV v bazální membráně epidermis

a bude-li to nutné

2. Uděláme biopsii ledvin a provedeme totéž vyšetření v bazálních membránách glomerulů a ledvinných kanálků

A jak řekli, tak udělali.

Jak to děláme my, laborantky

• Proti každému řetezci kolagenu IV je připravena protilátka. Standardně se vyšetřují řetezce 1,3,5

• Protilátky jsou označeny fluorescenční látkou, která září v UV světle

• Pokud jsou řetězce kolagenu IV normální, protilátky se na ně navážou a místo, kam se navázaly září v UV světle

• Pokud nejsou řetězce kolagenu IV normální, protilátky se nemohou navázat a to vidíme jako výpadek, absenci záření

Pracovní postup

• K detekci kolagenu IV., který je podkladem Alportova syndromu, používáme kit od firmy Wieslab, který je na parafinové i kryostatové řezy

• Kit obsahuje 3 monoklonální protilátky po jednom ml. MAB 1, MAB 3, MAB 5 a 3 lahvičky s roztokem glycerin/urea, který je nutno uchovávat při teplotě -18°C, protože se urea při vyšších teplotách pomalu rozkládá

Řezání a fixace

• Čerstvě odebranou tkáň kůže nebo ledviny řežeme na zmrazovacím kryostatu a to na plusová skla. Tloušťka řezu je 5-10 a na každé sklíčko neřežeme cca 4 řezy. Preparáty necháme na vzduchu zaschnout a fixujeme 10 minut acetonem. Vymyjeme 2×5 minut v PBS pufru o ph 7,6.

Denaturace roztokem glycerin/urea

• Řez pro MAB 5 se před aplikací primární protilátky denaturuje inkubací ve studeném roztoku glycerin/urea po dobu 5 minut, následuje vymytí v destilované vodě 2×5 minut.

Primární protilátky

• Řezy inkubujeme 1 hodinu naředěnými protilátkami MAB 1 a MAB 3, pouze protilátka MAB 5 se inkubuje 1,5 hodiny. Protilátky ředíme do PBS pufru, doporučené ředění je 1:25 až 1:75, optimální výsledky jsou při ředění 1:25. Na každé sklíčko kapeme 100 l naředěné protilátky, inkubují se ve vlhké komůrce při pokojové teplotě. Následuje vymytí v PBS pufru, a to 2×5 minut.

Sekundární protilátka

• K samotné vizualizaci reakce použijeme protilátku Ig antimyší značenou FITC naředěnou 1:10 v PBS pufru, inkubujeme 1 hodinu ve vlhké komůrce při pokojové teplotě.

Oplach a montování

• Následuje oplach v PBS pufru 2×5 minut a montování do fluorescenčního montovacího média od DAKa, které zajistí stabilitu záření několik dní. Lékař prohlíží sklíčka ve fluorescenčním mikroskopu.

Jak to vidí patolog v kůži

Kontrola MAB 1

Kontrola MAB 5

MAB 5, částečná pozitivita

MAB 5, negativní

Normální nález Patologický nález

MAB 1 je vždy pozitivníMAB 3 je v kůži vždy negativníPatologické změny u A-syndromu se týkají v kůži pouze MAB 5

Jak to vidí patolog v ledvině

Kontrola MAB 1

Kontrola MAB 3, 5

MAB 3

MAB 5

Normální nález Patologický nález

Patologické změny u A-syndromu v ledvinách se týkají MAB 3 i MAB 5.Projevují se kompletní nebo částečnou ztrátou pozitivity.

Jak je to s Jakubem Svozilem

• Bohužel, Jakub Svozil má Alportův syndrom a jeho maminka je přenašečkou porušeného genu. Podezření na toto onemocnění ukázala historie rodiny a potvrdila ho biopsie kůže a ledviny.

• Léčba tohoto onemocnění je obtížná, protože jde o poruchu genu. Je možné některé příznaky mírnit, ale účinná léčba je možná jen vnesením neporušeného genu do nemocné ledviny.